mRNA キャップ/ポリA・完全性評価

mRNA キャップ/ポリA・完全性評価が他モダリティと根本的に異なるのは、評価対象が「分子の塩基配列やサイズ」ではなく「翻訳開始と安定性を決める末端構造」である点にある。抗体ではCE-SDSやicIEFで純度・電荷異性体を見るが、mRNAでは5'キャップがCap0/Cap1/未キャップ化のどれか、その比率(キャッピング率)が翻訳効率と自然免疫回避を左右するため、ヌクレアーゼ消化後にLC-MSでキャップ構造を直接同定する手法が選定の軸になる。

ポリA長と完全性も、mRNA特有の選定基準を生む。ポリA鎖は安定性と翻訳持続を決めるため、長さ分布をキャピラリー電気泳動や質量分析で評価する。完全性(integrity)は、断片化した不完全鎖の割合を全長鎖に対して定量する指標で、in vitro転写直後・精製後・LNP封入前後・安定性試験の各時点で測る。AAVのキャプシド/ゲノム比やプラスミドの超らせん率とは観点が全く異なり、mRNA鎖そのものの劣化を追う点が固有である。

選定では、何を測るか(キャップ・ポリA・完全性のどれか)で装置クラスが分かれる。完全性・サイズ・ポリA長の概観は自動電気泳動が速く、キャッピング率や微量不純物・修飾ヌクレオシドの厳密同定はCE/LC-MS/MALDIが必要になる。注意点として、長鎖mRNA(数百〜数千nt)は二次構造で見かけサイズがずれるため変性条件が前提で、消化酵素・カラム・イオン化条件の最適化が結果を大きく左右する。