hERGアッセイ 自動パッチクランプとマニュアルの違いと使い分け

測り方には、大きく二つのやり方があります。ひとつは、細い針のようなガラス電極を人の手で細胞1個ずつに当てて測る「マニュアル法」。もうひとつは、小さな穴の並んだ板に細胞を吸い付けて、たくさんまとめて測る「自動法(自動パッチクランプ板の微小な穴に細胞を吸い付け、多数のウェルを一度に記録するパッチクランプ。高いスループットが特徴。)」です。自動法には384個の細胞を同時に測れる装置もあり、処理できる数(スループット一定時間に処理できる検体数。自動パッチクランプはマニュアル法より桁違いに多くの化合物を測れる。)はマニュアルとは桁違いです。

この二つは「同じ試験の速い版と遅い版」ではありません。得られるデータの品質、密着の良さ、温度の管理、そして規制当局にどれだけ受け入れられるか——それぞれが違います。品質とスループットのどちらを重く見るかは、探索段階なのか、それとも申請(GLP非臨床試験の信頼性を担保するための基準。申請用のhERG試験などで求められる。)を見据えた場面なのかで変わります。両者の違いを一つずつ見ながら、その使い分けを考えていきましょう。

パッチクランプという測り方の基本

hERGアッセイの土台にあるのが、細胞1個の膜に流れるごく小さな電流を測る「パッチクランプ細胞1個の膜に流れるごく小さな電流を測る電気生理学的手法。hERGアッセイの土台になる。法」です。まず細胞膜とガラス(または板)のあいだを、電気がほとんど漏れないほどぴったり密着させます。この密着部を「ギガシール細胞膜とガラスや板が電気的にほぼ漏れなく密着した状態。抵抗がギガオーム級で、測定の信頼性を左右する。」と呼びます。抵抗がギガオーム級と非常に高い、つまり隙間からの漏れがほぼない状態、という意味です。そのうえで膜に穴をあけ、細胞全体の電流をまとめて測れる「ホールセル膜に穴を開け、細胞全体を流れる電流をまとめて記録できるようにしたパッチクランプの状態。」という状態にすると、hERG を通る電流を安定して記録できます。

密着が甘いと、目的の電流に「漏れ電流」というノイズが混ざります。すると薬がチャネルを止めている度合いが実際より弱く見えてしまいます。⁠密着の良さ(シール品質)とホールセルの安定性が、hERGアッセイの信頼性を根本で決めます⁠。この物理はマニュアル法でも自動法でも同じです。違うのは、その品質をどう確保し、何個を同時にこなすかという運用面です。

温度も見落とせません。hERG の電流の動きは温度で変わるため、体温に近い温度で測れるかどうかも結果に直結します。ここは方式によって実装の得意・不得意が出やすいところです。

マニュアル法：一つひとつ丁寧に、位置づけは「お手本」

マニュアルパッチクランプは、熟練した人がガラス電極を細胞1個ずつに当てて記録する方法です。密着や膜の状態を人が目で見ながら「これは良い、これは捨てる」と選べる。そのため高い密着と安定したホールセルが得やすく、きめ細かい(分解能の高い)データが取れます。

この品質の高さから、GLP(信頼性を担保するための試験の決まりごと)に沿った hERG 試験では、マニュアル法が長く「お手本(ゴールドスタンダード)」とされてきました。QT の評価に関する国際的な指針である ICH E14/S7B、その補足資料(Q&A)が示すベストプラクティスに沿った試験でも、参照薬測定条件の妥当性を確かめる基準となる、既知の作用を持つ比較用の薬物。(比較の基準になる薬)の IC50 を精度よく求める場面で、マニュアル法が中心に使われています。

弱点は数です。1細胞ずつ手作業なので、1日に測れる化合物の数はどうしても限られ、人の腕にも左右されます。たくさんの候補を素早くふるいにかけたい探索の初期には、この遅さが足かせになります。

自動パッチクランプ：数で稼ぐ、探索の主力

自動パッチクランプは、板に開けた小さな穴に細胞を吸い付けて密着をつくり、多数のウェル(測定用の小さな区画)を一度に記録します。8ウェルほどの中規模の機械から、384ウェルを同時に測る大規模な機械まであり、装置によっては体温付近での測定にも対応します。

自動法で品質を守るカギは「ウェルごとの合格ライン(受け入れ基準)」です。実際の運用では、密着の値やピーク電流が一定以上に達したウェルだけを解析に使い、そうでないウェルは捨てます。文献では、ホールセル抵抗として概ね数百メガオームからギガオーム級を求める運用や、1ウェルに複数の細胞を使う「集団パッチクランプ」方式でギガシールの成功率が9割を超えるとする報告があります。ただしこうした数字は装置・細胞・手順しだいで変わるので、あくまで目安として捉えてください。

参照薬の IC50 は、条件をきちんと整えればマニュアル法とよく一致するとされています。一方で、手順の作り込みが甘いと「偽陰性本当は作用があるのに「ない」と誤って判定される結果。hERGでは阻害を見逃すリスクになる。」が混じることがあります。偽陰性とは、本当は hERG を止めるのに「止めない」と誤って出てしまうこと。これを見逃すと、医薬化学の判断を誤った方向へ導くリスクになる、と指摘されています。⁠自動法の値打ちはスループットにありますが、その品質はウェルの合格ラインの設計に強く左右されます⁠。

探索スクリーニングと申請(GLP)での使い分け

この二つは「どちらが上か」を競うものではなく、開発の段階ごとに役割が分かれます。用途で並べると次のようになります。

探索の初期は、「どの化学骨格が hERG を止めやすいか」を手早く見分けたい段階です。ここでは多数を同時に測れる自動法が向きます。この段階の IC50 は、化合物ごとの正確な絶対値を出すというより、候補を横並びにして「どれが危なそうか」を相対的に絞るための指標です。表の2行目にある構造活性相関(SAR)とは、分子の形をどう変えると効き目や毒性がどう変わるかの関係のこと。少しずつ骨格を変えて、hERG 阻害を下げる方向を探る作業です。この段階の詳しい考え方はhERGの安全域(セーフティマージン)の考え方で扱っています。

一方、非臨床の安全性評価として申請に使うデータには、より高い精度と再現性が求められます。ここでは基準法であるマニュアル法を GLP 下で用い、ICH S7B とその補足(Q&A)のベストプラクティスに沿って、参照薬を含む条件で IC50 とその信頼区間(値のばらつきの幅)を丁寧に求めます。得られた IC50 は、臨床での遊離血漿中濃度(Cmax投与後に達する最も高い血中濃度。薬がどれくらいの速さで届くかの指標。 free。血液中で効き目を持つ形で存在する薬の最高濃度)と見比べられ、安全域の評価に使われます。

使い分けを支える考え方：目的が精度を決める

「どちらが優れているか」という問いは、あまり実りません。どの品質が必要かは、その段階の目的で決まるからです。探索の初期は、多少の取りこぼしや空振り(偽陰性・偽陽性実際には結合や活性がないのに、計算や試験で当たりに見えてしまう候補。上位ヒットに必ず混じる前提で扱う。)があっても、数で稼ぐ意味があります。しかし開発が進むほど、誤ったデータが医薬化学の方向を狂わせたときの代償は大きくなり、精度への要求が上がっていきます。

hERG の結果だけで「この薬は心臓に悪い」と決めつけることはできません。ICH E14/S7B の枠組みでは、hERG のような試験管内(in vitro生きた動物の体外で、試験管やシャーレなどを用いて細胞・組織・分子レベルで行う実験を指す用語。)の試験、動物での QT 評価、そして臨床での評価を組み合わせて総合的に判断します。自動とマニュアルの使い分けは、この総合評価のなかで「どの段階に、どの品質のデータを差し込むか」を決める運用の話だと捉えると、位置づけが見えやすくなります。

まとめ

自動パッチクランプとマニュアルは、測っている中身(ギガシール下のホールセル電流)は同じです。差が出るのは品質の確保のしかた、温度管理、スループットの三点。自動法は384ウェル同時測定に代表される高いスループットで、探索スクリーニングとリード最適化を支えます。マニュアル法はきめ細かさと選別のしやすさから、GLP 下の申請用評価で基準として使われます。

使い分けの軸は、その段階で求める精度です。探索の初期は数でふるいにかけ、開発が進むほど基準法で精度を固める。この流れを ICH医薬品規制の国際調和を目的として、日米欧の規制当局と製薬業界が参加する国際的なガイドライン策定機関。 E14/S7B の総合評価のなかに位置づけることで、hERGアッセイのデータは意味を持ちます。個々の値は装置・細胞・手順によって変わるので、自分たちの装置での検証と、参照薬による裏取りを前提に読むことが大切です。

参考文献

• ICH S7B, Nonclinical Evaluation of the Potential for Delayed Ventricular Repolarization (QT Interval Prolongation) by Human Pharmaceuticals
• ICH E14/S7B Q&As, Clinical and Nonclinical Evaluation of QT/QTc Interval Prolongation and Proarrhythmic Potential
• FDA, S7B Nonclinical Evaluation of the Potential for Delayed Ventricular Repolarization (QT Interval Prolongation) by Human Pharmaceuticals
• EMA, ICH S7B Non-clinical evaluation of the potential for delayed ventricular repolarization (QT interval prolongation) by human pharmaceuticals