形質転換・株選抜
発現株構築後の選択培養や、栄養要求性マーカーによるクローン選抜に規定培地を使う。
- 選択培養
- クローン選抜
酵母 発酵培養用培地(Pichia/Saccharomyces)は、Pichia pastoris(Komagataella)やSaccharomyces cerevisiaeを高密度まで増殖させ、組換えタンパク質を発現させるための規定培地・複合培地である。大腸菌や哺乳類細胞とは選定軸が異なり、メタノール誘導(AOX1系)やグリセロール/グルコース増殖相、基礎塩培地+PTM1微量塩、分泌発現を前提とするため、宿主と発現様式に合わせた培地系で選定が全く変わる。
酵母発酵は大腸菌より遅く哺乳類細胞より速い増殖で、グリセロールや糖を炭素源に高密度(湿菌体で数百g/L規模)へ到達します。Pichiaではメタノール資化(AOX1プロモーター)による誘導発現が主流で、培地はグリセロール増殖相用とメタノール誘導相用に分かれ、基礎塩培地にPTM1微量塩を組み合わせる構成が定番です。大腸菌のリッチ培地・自己誘導とも、CHO培地の糖鎖・比産生軸とも違い、メタノール供給制御と溶存酸素・発熱・pH維持が培地選定の前提になります。
宿主と発現様式で選定が大きく変わるのも酵母特有です。Pichia高密度発酵では基礎塩+PTM1のミネラル培地(pH制御・流加)が標準で、緩衝化したグリセロール/メタノール複合培地(YNB+ペプトン系)は振盪培養や分泌発現の評価に向きます。一方Saccharomyces中心の系では規定培地(YNB±アミノ酸)による栄養要求性マーカー選択や、複合培地(YPD)での増殖が軸になり、メタノール誘導前提のPichia系培地はそのままでは使いません。分泌発現か細胞内発現か、糖鎖(高マンノース型)を許容するかでも最適な培地・誘導戦略が分かれます。
他モダリティでは銘柄も選定基準も置き換わります。大腸菌発酵では原核用リッチ培地や封入体回収が論点ですが、酵母ではメタノール毒性管理・PTM1微量塩・分泌タンパク質の安定性が選定軸になります。CHO/HEK293の本培養では無血清・化学的定義培地が中心で、酵母用の規定培地・基礎塩培地は使われません。逆に酵母では動物由来成分フリーやスケールアップ時の溶存酸素確保は重要でも、電荷異性体のような哺乳類特有CQAは選定軸に入りません。
基本的には、宿主と発現様式(メタノール誘導/構成的、分泌/細胞内)に合わせて増殖相と誘導相の培地を選び、前培養から高密度本発酵へ進めます。
酵母発酵用培地は、株の立ち上げから高密度本発酵、メタノール誘導までの微生物上流工程で使われます。
発現株構築後の選択培養や、栄養要求性マーカーによるクローン選抜に規定培地を使う。
本発酵へ渡す菌体を立ち上げる前培養に複合培地やグリセロール培地を使う。
ジャーやバイオリアクターでの高密度培養で基礎塩培地とPTM1微量塩、グリセロール流加を使う。
AOX1系のメタノール誘導で目的タンパク質の発現を立ち上げ、メタノール濃度を制御する。
酵母発酵用培地は微生物発酵モダリティの中核で、哺乳類細胞系のモダリティでは選定基準も銘柄も置き換わります。