封入体のリフォールディングとは？フォールディングと凝集の競合で収率が決まる

大腸菌で目的のタンパク質を高発現させたのに、細胞内で不溶化していた。多くの研究者はここでがっかりしますが、封入体は本当に失敗の印でしょうか。実は、体積あたりの収量が高いことを理由に、あえて封入体として発現させる工業プロセスがあります。

封入体は、目的のタンパク質が不溶性の凝集体になったもので、そのままでは活性がありません。ただ、高い純度で濃縮された状態でもあり、プロテアーゼ（タンパク質分解酵素タンパク質を分解する酵素。破砕で放出され目的物を分解するため低温や阻害剤で抑える。詳しく →）にも分解されにくい。その代償が、変性剤で可溶化してから天然の立体構造に戻すリフォールディングです。この工程はフォールディングと凝集の競合で、凝集に回った分は失われます。

製造の担当にとっては収率、購買にとっては試薬と設備の量、品質保証にとっては正しくフォールディングした分子かどうかの見方。どれも、この競合の結果に直結します。

封入体の洗浄と可溶化：なぜ前処理がリフォールディングの収率を左右するのか？

洗浄と可溶化の条件のぶれが、そのままリフォールディング収率のぶれとして現れるからです。 封入体の処理は、洗浄、可溶化、リフォールディングの三段階です。

菌体破砕は菌体破砕の条件の決め方に、精製全体の流れは微生物由来タンパク質の精製にあります。

完全に変性させるのが、常に正しいのか？

そうとは限りません。封入体の中のタンパク質は、完全に変性した状態ではなく、天然に近い構造を残していると考えられています。この性質を使うのが、低濃度の尿素と高いpHの組み合わせで、構造をある程度残したまま可溶化するマイルド可溶化です。活性の回収率が上がった例を、2015年の総説（Singh ら）がまとめています。

封入体の処理は経験則に頼りがちで、モニタリングと管理が足りないと指摘する総説もあります。

重要：凝集との競合に勝つには、なぜ低濃度で変性剤を除くのか？

フォールディングは濃度に左右されず、凝集は濃度が下がるほど大きく遅くなるからです。 変性剤を除くと、ポリペプチド鎖はフォールディングを始めます。ここから、フォールディングと凝集の競合が始まります。

• フォールディング（分子内の反応）：一つの分子の中で進む。濃度を半分にしても、速さは変わらない。
• 凝集（分子間の反応）：二つ以上の分子が出会って進む。濃度を半分にすると、4分の1以下に落ちる。

溶液が希薄で、分子どうしが出会いにくいほど、凝集は起きにくくなります。だからリフォールディングは、精製工程としては非常に低い濃度、1 mLあたり10〜100 µgほどで行うのが基本です。

ただし、低濃度にすると液量が増えます。数千リットル規模のタンクが必要になることもあります。そこで、変性剤の除き方の選択が、設備の規模を左右します。

希釈の変形に、変性タンパク質の溶液を少しずつ加える流加（パルス）方式があります。すでにリフォールディングした分子は凝集に加わりにくいので、その時点の変性タンパク質の濃度だけを低く保てます。モデルタンパク質のリゾチーム細菌の細胞壁（ペプチドグリカン）を分解して壁を弱める酵素。菌体の酵素的溶解に使う。詳しく →を使い、変性剤の濃度、酸化還元の比、注入速度など五つの因子を組み合わせて振った研究（Mannall ら、2007年）では、工業的な濃度での収率に、とくに変性剤の濃度、酸化還元の比、注入速度が効きました。液量が制約になったとき、最初に検討する手です。

温度も効きます。冷やすとフォールディングも凝集も遅くなりますが、凝集のほうがより強く抑えられることが多く、結果として収率が上がる場合があります。条件の詰め方はリフォールディング条件の最適化にあります。

アルギニンと酸化還元系：凝集の抑制とジスルフィド結合の再形成にどう効くのか？

アルギニン分子どうしの会合による凝集を抑え、高濃度処方では粘度を下げる働きも知られるアミノ酸。詳しく →などの添加剤は凝集を抑え、酸化還元系は誤ったジスルフィド結合を開いて正しく掛け直せる環境をつくります。 希釈だけでは足りないとき、この二つを検討します。

添加剤（L-アルギニンなど）

代表的なのがL-アルギニンです。凝集を抑える添加剤として広く使われていますが、作用機序薬が効果を発揮する仕組み。抗体医薬ではADCCやCDCなどが該当し、アッセイで裏づける。詳しく →は完全には説明されていません。フォールディング中間体や変性した分子の溶解性を上げながら、天然状態の安定性はあまり変えない、と考えられています。

• 濃度⁠：0.5 M前後で検討されることが多い。高ければ高いほどよいわけではない。
• 限界⁠：ジスルフィド結合を持つタンパク質の一部には、効かないことも報告されている。
• ほかの添加剤⁠：スクロースやグリセロール、低濃度の界面活性剤、PEGなども、場面によって効く。

酸化還元系（還元型・酸化型グルタチオン）

ジスルフィド結合を持つタンパク質では、もう一つ条件が要ります。還元剤ですべて切った状態から、正しいシステインの組み合わせで結合を再形成しなければなりません。ただ酸化すればよいのではなく、一度できた誤った結合を開いて掛け直せる（ジスルフィド交換が起きる）環境が必要です。そのため、還元型と酸化型のチオール（システイン側鎖の SH 基）を共存させます。グルタチオンなら還元型を多めに、10対1くらいの比で置くのが定番です。pHは弱アルカリ性が目安。低すぎるとジスルフィド交換が止まり、高すぎるとタンパク質そのものが不安定になります。

見落としやすいのが、可溶化で入れた還元剤の持ち込みです。DTTがリフォールディング液に残ると、環境が還元側に寄り、いつまでもジスルフィド結合が形成されません。希釈倍率か、脱塩工程を一段入れて、ここを切っておきます。

正しくフォールディングしたかは、なぜ活性と構造（SEC・遊離チオール）の両方で見るのか？

SEC分子を天然に近い条件でサイズにより分ける液体クロマトグラフィー。凝集体の主要な定量法。詳しく →で単量体に見えても、ジスルフィド結合の組み合わせが誤っている分子を区別できないからです。 収率の定義を決めておかないと、条件出しが進みません。

いちばん確かな指標は活性です。酵素なら比活性タンパク質の量あたりの生物活性の強さです（活性の単位をタンパク質の質量で割った値）。同じ量でどれだけ働くかを表し、精製の進み具合や製品の品質の指標に使います。詳しく →、受容体結合タンパク質ならその結合を見ます。ただし、測定に時間がかかる系では、条件を振る回数が稼げないため、構造側の指標を併用します。

収率が伸びないとき、どの順で原因を調べるのか？

濃度、還元剤の持ち込み、酸化還元系とpH、添加剤と温度の順に調べると、原因に届きやすくなります。

一方で、そもそも封入体にしない道もあります。ペリプラズム大腸菌の内膜と外膜の間の区画。細胞質より酸化的で、ジスルフィド結合が形成されやすい。詳しく →（内膜と外膜のあいだ）に分泌させて可溶性で発現させる方法は大腸菌のペリプラズム発現・分泌で解説しています。

リフォールディングの条件を見直すとき、明日から何を確かめるのか？

濃度、変性剤の除き方、還元剤の持ち込み、収率の定義を、記録で確かめます。 自社の条件を見直すときや、委託先の工程を聞くときに使ってください。

• 濃度と液量⁠：リフォールディング液のタンパク質濃度と、液量の見積もりがあるか
• 変性剤の除き方⁠：希釈、透析・限外ろ過、カラム上のどれを選んだか、理由が説明できるか
• 還元剤の持ち込み⁠：可溶化で入れた還元剤が、リフォールディング液にどれだけ持ち込まれるかを記録しているか
• 酸化還元の条件⁠：酸化還元系の比と総濃度、pH、温度を、実測値で残しているか
• 収率の定義⁠：活性と構造（単量体の割合、遊離チオールなど）の両方で見ているか
• 封入体のロット⁠：ロットが変わったときに、洗浄と可溶化の条件を見直す手順があるか

試薬は封入体の可溶化・リフォールディング試薬、濃縮とバッファ交換はTFFシステム、単量体の割合はSEC-HPLCのページで比べられます。インスリンの前駆体に当てはめた具体例はプロインスリンのリフォールディングと酵素的変換と組換えインスリンの製造にあります。

参考文献

• Singh A, Upadhyay V, Upadhyay AK, Singh SM, Panda AK. Protein recovery from inclusion bodies of Escherichia coli using mild solubilization process. Microb Cell Fact. 2015;14:41. PMC4379949（穏やかな可溶化）
• Wanted: more monitoring and control during inclusion body processing（封入体処理の管理の課題）
• Lange C, Rudolph R. Suppression of protein aggregation by L-arginine. Curr Pharm Biotechnol. 2009. eurekaselect.com（アルギニンの凝集抑制）
• Mannall GJ, Titchener-Hooker NJ, Dalby PA. Factors affecting protein refolding yields in a fed-batch and batch-refolding system. Biotechnol Bioeng. 2007.（流加方式でのリフォールディング収率に効く条件）
• Pauk JN, Raju Palanisamy J, Kager J, Koczka K, Berghammer G, Herwig C, Veiter L. Advances in monitoring and control of refolding kinetics combining PAT and modeling. Appl Microbiol Biotechnol. 2021;105(6):2243-2260. doi:10.1007/s00253-021-11151-y（レビュー。希釈によるリフォールディングの課題：大量の緩衝液溶液のpHを一定範囲に保つために使用される弱酸と共役塩基の混合溶液。詳しく →とタンク容量、均一な混合、低濃度での分析、低い収率）
• ICH Q6B生物薬品の規格・試験方法の設定の考え方を示すICHガイドライン。力価などの規格を扱う。詳しく →, Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products（特性解析と規格設定の考え方）