微生物由来タンパク質の精製とは？破砕とエンドトキシンが工程を決める

微生物由来タンパク質の精製は、大腸菌などの菌体の中にある目的のタンパク質を取り出し、不純物を落とす工程です。培養液の上清から取ればよい動物細胞の培養と違い、最初にするのは菌体を壊して中身を出すことです。

ただし、強く壊すほど中身はよく出る一方で、大腸菌の外膜に由来するエンドトキシングラム陰性菌の外膜由来の発熱性物質（LPS）で、注射剤では厳しく管理し、LAL試験などで測定します。詳しく →とDNAも出てくるため、後ろの工程が重くなります。

この記事では、破砕の考え方、可溶性と封入体の違い、清澄化と多段クロマトグラフィー固定相と移動相の間での物質の相互作用（分配・吸着・イオン交換など）の差を利用して、混合物中の成分を分離・精製する操作の総称。詳しく →、エンドトキシンの落とし方と規格、確かめる点を順に説明します。

1. 壊し方が後工程を決める：破砕はどう考えるのか？

微生物の精製には、動物細胞の工程にはない前段が2つあります。菌体を壊すことと、大腸菌の外膜に由来するエンドトキシンを落とすことです。AAVやmRNAの製造に使うポリメラーゼ、ヌクレアーゼ核酸を分解する酵素です。製造では培養由来の残存DNA/RNAを分解・除去して製品の純度を高める目的で使い、ベンゾナーゼが代表例です。詳しく →、リガーゼといった酵素の多くも、この経路を通って出てきます。

発酵が終わったら、遠心機かマイクロフィルトレーションで培地と分けて菌体を集め、緩衝液溶液のpHを一定範囲に保つために使用される弱酸と共役塩基の混合溶液。詳しく →に懸濁し直して壊します。

破砕の標準は高圧ホモジナイザーで、懸濁液を高い圧で狭い隙間から噴出させ、せん断と急な減圧で細胞壁を壊します。大腸菌のようなグラム陰性菌外膜をもつ細菌の分類。大腸菌が代表で、比較的壊しやすく外膜にエンドトキシンをもつ。詳しく →は比較的壊れやすく、酵母やグラム陽性菌は壁が頑丈なため、同じ液を何度も通すことがあります。

高い圧では、通す回数を増やしても、出る量はほとんど増えません。大腸菌を50〜1,500 barの範囲で1〜5回通して調べた研究では、1,000〜1,500 barの高い圧で、タンパク質が出る量も、細胞が小さくなる程度も、1回目でほぼ頭打ちでした。

一方、500 barの中程度の圧では、回数に応じて出る量が増えました。だから、回数を増やす前に確かめるのは、使う圧と、1回目でどこまで出るかです。

壊しすぎると、後ろの工程の負荷が増えます。残骸が細かくなると遠心で沈みにくく、ろ過では目詰まり微粒子や凝集体、タンパク層が膜の孔を塞いでろ過が落ちる現象。プレフィルターでの前段保護が効く。詳しく →しやすくなるうえ、遊離するエンドトキシンも増えます。

遊離するDNAは液の粘りを上げるため、遠心の前にヌクレアーゼで分解して粘度を下げることがあります。また、壊すときに熱が出るので、パスの間に冷却を挟まないと、目的のタンパク質が先に傷みます。

破砕の条件は、回収率だけでなく、後ろの工程の負荷を決める設計変数です。

2. 工程の長さが変わる：可溶性か封入体かで、何が違うのか？

壊した液を遠心すると、目的のタンパク質が上清にいるか、沈殿にいるかが分かります。

上清にいる可溶性なら工程は短く、清澄化してそのままクロマトグラフィーに進めます。発現温度を下げる、可溶化タグ（MBPやSUMOなど）を付ける、シャペロンタンパク質の折りたたみを助ける分子。共発現させると折りたたみ効率が上がり凝集が減ることがある。詳しく →（折りたたみを助けるタンパク質）を一緒に作らせるといった上流の工夫は、すべて目的物を上清に持ってくるためのものです。

沈殿にいるのは封入体で、目的のタンパク質が不溶性の凝集体タンパク質分子どうしが結合してできた高分子量の集合体です。有効性や免疫原性に影響するため、その含量を測ります。詳しく →として溜まっており、そのままでは活性がありません。封入体には、純度が高く、プロテアーゼにも分解されにくいという良い面もあります。

問題は、活性を取り戻すために溶かしてリフォールディングする2つの工程が加わり、そこが歩留まり製造工程で投入した原料や中間体に対し、最終的に規格に合った製品として回収できた割合を指し、低いほどコスト増につながる。詳しく →の中心になることです。封入体からの回収は、次の3段で進めます。

1. 洗浄⁠：膜の断片や宿主のタンパク質、DNA、エンドトキシンを洗って落としておきます。
2. 可溶化⁠：高濃度の変性剤で溶かし、ジスルフィド結合があれば還元します。
3. リフォールディング⁠：変性剤を抜いてリフォールディングします。このとき凝集すると、その分を失います。

凝集を抑えるため、液を大きく薄め、アルギニン分子どうしの会合による凝集を抑え、高濃度処方では粘度を下げる働きも知られるアミノ酸。詳しく →などの凝集抑制剤を入れ、温度、pH、希釈の速さを振って条件を探します。詳しくは封入体リフォールディングで、試薬は封入体の可溶化・リフォールディング試薬で比べられます。

3. 不純物ごとに担当の段を決める：清澄化と多段クロマトはどう割り振るのか？

壊した液もリフォールディングした液もそのままでは濁っているので、遠心とデプスフィルターで粒子を落とし、TFFシステムで濃縮とバッファ交換をしてから、クロマトグラフィーに掛けます。

デプスフィルターは粒子だけでなく、DNAや宿主のタンパク質の一部も抱え込むので、後ろのカラムの寿命が変わります。

クロマトは、捕捉、中間、仕上げの三段が基本です。抗体にはProtein A抗体に特異的に結合するProtein Aを担体に固定し、抗体だけを選択的に捕まえて精製する手法です。抗体医薬の最初の精製工程として定番になっています。詳しく →という決まった捕捉の担体がありますが、微生物で作る酵素やペプチドには汎用で効く担体が少ないため、Hisタグを付けて金属アフィニティ特定の相互作用を使って目的物を選択的に捕まえる精製法。ヘパリンやタグへの親和性などを利用する。詳しく →で捕まえるか、イオン交換で捕まえます。

FUJIFILM Biotechnologies は、タグを付けて汎用のレジンクロマトグラフィーで目的物や不純物を結合させる粒子状の充填材。精製モードごとに使い分ける。詳しく →で捕まえ、精製後に専用のプロテアーゼで痕を残さず切り離す技術を披露しています（ニュース）。

設計で決めるのは、どの不純物をどの段で落とすかの割り振りです。とくに陰イオン交換は働きが大きく、負に荷電したDNAとエンドトキシンをまとめて吸着するので、目的物が中性から塩基性なら、素通しで通して不純物だけを止められます。

レジンのほかに膜の吸着体も使え、使い分けはメンブレンクロマトグラフィーで解説しています。

多段クロマトの設計とは、不純物ごとに担当の段を決めることです。

4. 重要：大腸菌で必ず出るエンドトキシンは、どう落とすのか？

大腸菌を使う限り、外膜のリポ多糖（LPS）であるエンドトキシンが、破砕で大量に遊離します。

LPSは負の電荷と、長い脂質の鎖の疎水性を併せ持つため、目的のタンパク質と電気的にも疎水的にもくっつき、加熱でも普通のろ過でも落ちません。そのため、原理の違う手法を重ねます。

• 陰イオン交換の素通し⁠：最初に、負の電荷を利用して大半を落とします。
• Triton X-114温度を上げると相分離する界面活性剤で、疎水性を利用してLPSを抽出除去する。 の相分離⁠：界面活性剤の相分離を使い、疎水性を利用して落とす代表的な方法です。
• 除去用の膜⁠：既存のろ過に組み込みやすい反面、吸着できる量に上限があるため、負荷が下がった後ろの仕上げに向きます。
• ポリミキシンBを固定した担体カラムに充填する多孔質ビーズ。表面のリガンドと成分の相互作用差で目的物と不純物を分離する。詳しく →⁠：選択性が高いものの、リガンドリガンドとは、受容体などのタンパク質の決まった部位に特異的に結合する分子です。クロマトグラフィーでは、担体ビーズの表面に固定し、目的物や不純物と相互作用させて分離を担う官能基やタンパク質を指します。詳しく →が漏れ出すため、最終工程には置きにくいとされます。

それぞれの手法は、エンドトキシンの管理と除去で詳しく解説しています。

規格は投与経路で決まり、一般の注射剤なら体重1 kgあたり5 EU、髄腔内に投与するものはその25分の1の0.2 EUです。残存DNAと宿主のタンパク質の規格も、投与経路と用量から、ICH Q6B生物薬品の規格・試験方法の設定の考え方を示すICHガイドライン。力価などの規格を扱う。詳しく → の考え方に沿って決めます。

測定は、USP ⟨85⟩ と日本薬局方のエンドトキシン試験法に沿ったLAL法が基本で、組換えファクターC法カブトガニ試薬を使わず、組換え酵素でエンドトキシンを測定する試験法。も使われます（両者の違い）。

注意したいのは、エンドトキシンがタンパク質とくっついていると、測定値が実態より低く出ることです（低エンドトキシン回収）。そのため、希釈の系列で干渉を確かめてから規格と突き合わせます。

落としきれないときはどうするか。精製の条件ではなく、破砕と洗浄の条件まで戻り、くっつく前の段階で抑えたほうが早いことがあります。

5. 明日から、何を確かめられるのか

工程を組む人にも、酵素の原料を選ぶ購買にも、規格を読む品質保証にも、壊し方と落とし方の関係は直接つながっています。工程を組むとき、あるいは酵素の供給元の工程を聞くときは、次の順で確かめると抜けが出にくくなります。

• 目的物の出る場所⁠：目的物が上清と沈殿のどちらに出るかを実測します。封入体なら、リフォールディングの収率の見積もりがあるかを確かめます。
• エンドトキシンの規格⁠：投与経路から、エンドトキシンの規格を引きます。
• 破砕の条件⁠：破砕の圧とパスの回数を、回収率だけでなく、清澄化培養液から細胞や破片を取り除いて目的物質を含む上清を回収し、後工程に渡せる清澄な液にする工程です。詳しく →のろ過面積とエンドトキシンの負荷まで見て決めます。壊したあとの粘度を下げる手当て（ヌクレアーゼなど）が工程に入っているかも確かめます。
• クロマトの各段の担当⁠：各段がどの不純物を落とす担当か決まっているかを確かめます。陰イオン交換でDNAとエンドトキシンを任せるなら、目的物の等電点から、素通しで通せる運転のpHを決めておきます。
• 工程の途中での測定⁠：宿主のタンパク質、残存DNA製造に使った宿主細胞に由来するDNAの不純物です。安全性の観点から、精製後にどれだけ残っているかを測る試験です。詳しく →、エンドトキシンを、工程の途中の液でも測れるかを確かめます。測れれば、規格を外したときに、どの段が効いていないかが分かります。

製品は、高圧ホモジナイザー、デプスフィルター、TFFシステム、クロマトグラフィーシステム、エンドトキシン試験のページで比べられます。エンドトキシンの試験と管理は抗体医薬のエンドトキシン管理にもまとめています。上流の発酵は微生物発酵の製造解説、宿主の選び方は宿主・発現系の選び方で解説しています。

参考文献

• Ramanan RN, Tey BT, Ling TC, Ariff AB. Classification of pressure range based on the characterization of Escherichia coli cell disruption細胞内に溜まった目的タンパク質を回収するため、微生物の細胞を壊す精製の入口工程。詳しく → in high pressure homogenizer. Am J Biochem Biotechnol. 2009;5(1):21-29. Monash University 研究リポジトリ（大腸菌を50〜1,500 bar、1〜5回で調べた破砕の研究）
• Yamaguchi H, Miyazaki M. Refolding techniques for recovering biologically active recombinant proteins from inclusion bodies. Biomolecules. 2014;4(1):235-251. PMID: 24970214. PubMed（封入体の洗浄、可溶化、リフォールディングの条件）
• Schneier M, Razdan S, Miller AM, et al. Current technologies to endotoxin detection and removal for biopharmaceutical purification. Biotechnol Bioeng. 2020;117(8):2588-2609. PMID: 32333387. PubMed（エンドトキシンの性質と、除去手法の整理）
• Petsch D, Anspach FB. Endotoxin removal from protein solutions. J Biotechnol. 2000;76(2-3):97-119. PMID: 10656326. PubMed
• Rosano GL, Ceccarelli EA. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol. 2014;5:172. PMID: 24860555. PubMed（可溶性と封入体、発現の工夫）
• USP ⟨85⟩ Bacterial Endotoxins Test製品中のエンドトキシンを検出・定量するバクテリアエンドトキシン試験の総称。詳しく →／日本薬局方「エンドトキシン試験法」／European Pharmacopoeia欧州医薬品品質局（EDQM）が発行する、医薬品の品質基準を定めた公定書で、署名国・加盟国の規制に法的効力を持つ。詳しく → 2.6.14 Bacterial Endotoxins（LAL法等による公定法）
• ICH医薬品規制の国際調和を目的として、日米欧の規制当局と製薬業界が参加する国際的なガイドライン策定機関。詳しく → Q6B: Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products（宿主由来不純物の規格設定の考え方）
• FUJIFILM Biotechnologies, ShunzymeX precision purification technology（発表）（タグの付け外しによる精製）