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微生物由来タンパク質の回収・精製とは？菌体破砕からエンドトキシン除去まで
微生物・発酵基礎知識・製造工程

微生物由来タンパク質の回収・精製とは？菌体破砕からエンドトキシン除去まで

Proglenth 編集部2026-06-11約11分で読めます

微生物（とりわけ大腸菌）は、増殖が速く培地コストが低く、高密度培養で目的タンパク質を大量に発現できることから、酵素・サイトカイン・成長因子・抗体フラグメント・ペプチド原薬など幅広いバイオ医薬の生産宿主として広く使われています。遺伝子治療・再生医療のCMC文脈でも、AAVやmRNAの製造に用いる酵素類（ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、リガーゼ等）の多くが微生物発酵で供給されており、その品質はダウンストリーム（回収・精製）工程に大きく依存します。動物細胞培養と異なり、微生物は基本的に細胞内に目的物を蓄積するため、「まず菌体を壊して中身を取り出す」という固有の前段が必要になります。

菌体回収と破砕：細胞内タンパク質を取り出す

発酵終了後の培養液から、まず菌体を回収します。一般的には連続式遠心分離（ディスク式遠心機）またはマイクロフィルトレーションによる膜濃縮が用いられ、上清（培地）と菌体を分離します。多くの微生物発現系では目的物が細胞内に蓄積するため、回収すべきは上清ではなく菌体（ペレット）側です。回収した菌体は破砕緩衝液に再懸濁し、必要に応じて洗浄して残存培地成分を低減します。

菌体破砕の標準法は高圧ホモジナイザーです。高圧（典型的には数百〜1,500 bar程度）でセルを狭いバルブ間隙から噴出させ、せん断力・キャビテーション・急減圧によって細胞壁を機械的に破壊します。グラム陰性菌である大腸菌は比較的破砕しやすい一方、酵母や一部のグラム陽性菌は細胞壁が頑強で複数回パス（通過）を要することがあります。ラボスケールでは超音波破砕やビーズミル、酵素的溶菌（リゾチーム）も用いられますが、製造スケールで再現性と処理量の両立に最も適するのは高圧ホモジナイザーであり、パス回数・圧力・温度を管理することで破砕度と発熱・断片化のバランスを取るのが要点です。破砕は発熱を伴うため、品質劣化を避けるべく冷却と温度モニタリングが欠かせません。なお過度な破砕はDNAや微細な菌体デブリの遊離を増やし、後段の清澄化負荷とHCP・DNA除去負荷を高める点に注意が必要です。

可溶性発現と封入体発現で精製戦略が分かれる

破砕後の挙動は、目的タンパク質の発現形態によって大きく異なります。可溶性発現か封入体発現かが、後続の工程設計全体を規定する最初の分岐点です。

可溶性発現の場合、破砕液を遠心または深層ろ過で清澄化し、上清（可溶性画分）をそのままアフィニティーやイオン交換などのクロマトグラフィーに供します。フォールディング工程が不要なため工程が短く、活性回収率も一般に高くなります。発現量と可溶性を両立させるため、発現温度の低下、強度の弱いプロモーター、シャペロン共発現、可溶化タグ（MBP、SUMO、Trxなど）といった上流の最適化がしばしば併用されます。

封入体発現の場合、目的物は不溶性凝集体として沈殿画分に分配されます。封入体は比較的純度が高く分解されにくいという利点がある一方、生物活性を得るには「可溶化（変性剤による分散）→リフォールディング（変性剤除去による再生）」が必須です。この追加工程は収率の主要な律速であり、可溶性タグ等の対策にもかかわらず封入体になる場合は、リフォールディング条件のスクリーニングが品質と原価の双方を左右します。封入体・可溶性いずれを採るかは、発現量、フォールディング難易度、ジスルフィド結合の有無、コスト、規制上の管理性を踏まえて設計時に意思決定されます。

封入体の可溶化とリフォールディング

封入体の典型的な処理フローは、洗浄→可溶化→リフォールディング→（必要に応じ）クロマト精製です。まず封入体ペレットを低濃度の界面活性剤やマイルドな変性剤、塩を含む緩衝液で洗浄し、膜断片・HCP・DNA・LPSなどの随伴不純物をできるだけ取り除きます。この洗浄の質が最終のエンドトキシン・HCP規格達成に直結します。

可溶化は、高濃度のカオトロピック剤（尿素6〜8 M、塩酸グアニジン6 M程度）で凝集体を解きほぐし、ポリペプチド鎖を変性・分散させます。ジスルフィド結合をもつタンパク質では還元剤（DTT、β-メルカプトエタノール）を併用します。近年は、二次構造をある程度保ったまま分散させる「マイルド可溶化」によって、強い変性条件で起こる構造破壊や凝集を抑え、活性回収率を高める手法も報告されています（Singh et al. 2015）。リフォールディングは変性剤を希釈・透析・段階的バッファー交換などで除去し、天然構造へ巻き戻す工程です。希釈リフォールディングが基本ですが、ジスルフィド架橋を伴う場合は酸化還元対（還元型/酸化型グルタチオンなど）でレドックス環境を整え、低濃度のアルギニンなどの凝集抑制剤を添加することが一般的です。リフォールディング収率は系依存性が高く、トライアンドエラーになりがちで、温度・pH・タンパク質濃度・変性剤残存濃度・希釈速度といったパラメータの体系的スクリーニングが鍵になります（Yamaguchi & Miyazaki 2014）。詳細は封入体リフォールディングの解説を参照してください。

清澄化とクロマトグラフィー精製

破砕液やリフォールディング液は、菌体デブリ・凝集体・微粒子を含む濁った液であり、クロマトへ供する前に清澄化が必要です。製造では遠心分離とデプスフィルター（深層ろ過）の組み合わせが標準的で、デプスフィルターは厚みのあるろ材内部に粒子と一部の不純物（DNA、HCPの一部）を捕捉し、後段の精密ろ過・クロマトカラムの負荷と目詰まりを軽減します。緩衝液交換や濃縮にはTFFシステム（タンジェンシャルフローろ過）が用いられ、リフォールディング後の希薄液の濃縮やバッファー交換に有効です。

精製本体はクロマトグラフィーシステムによる多段クロマトグラフィーです。代表的な組み合わせは、捕捉（キャプチャー）にアフィニティー（Hisタグ＋IMAC、特異的リガンド等）やイオン交換、中間精製・研磨（ポリッシュ）に陰イオン交換（AEX）・陽イオン交換（CEX）・疎水性相互作用（HIC）・サイズ排除（SEC）を段階的に配置する流れです。重要なのは、各ステップが目的物の精製だけでなく不純物クリアランスにも寄与する点で、とくに陰イオン交換は負電荷をもつDNAとエンドトキシン（LPS）の除去に有効に働きます。フロースルー方式のAEX研磨は、目的物を素通りさせ酸性不純物を吸着させる定番のポリッシュ手段です。

宿主由来不純物（HCP/DNA）とエンドトキシン（LPS）の除去

微生物精製では、目的物の純度に加えて宿主由来不純物（HCP: host cell protein、宿主DNA）と、大腸菌に固有のエンドトキシン（LPS）の管理が品質規格の中心になります。HCPは免疫原性・酵素活性（プロテアーゼ等による分解）の観点から、宿主DNAは規制上の残存DNA規格の観点から、いずれもppm〜pg/dose水準まで低減することが求められ、ELISA（HCP）やqPCR（残存DNA）でモニタリングします。これらはクロマト多段（とくにAEX）と深層ろ過の組み合わせで段階的にクリアランスします。

エンドトキシン（LPS）は、グラム陰性菌の外膜由来のリポ多糖で、注射剤では発熱性物質として厳しく規制されます。破砕で大量に遊離し、負電荷とアシル鎖（疎水性）を併せもつため、目的タンパク質と静電的・疎水的に複合体を形成して共精製されやすいのが厄介な点です（Schneier et al. 2020）。除去戦略としては、(1) 陰イオン交換（フロースルーAEX）でLPSの負電荷を利用して吸着除去、(2) ポリミキシンB固定化アフィニティーなどLPS結合リガンドの活用、(3) Triton X-114等による相分離抽出（疎水性を利用）、(4) 限外ろ過（ただし目的物がLPSと複合体を作っていると効果が限定的）などが組み合わされます。最終製剤はエンドトキシン試験（LAL法：ゲル化法・比濁法・比色法、または組換えファクターC法）で規格適合を確認します。エンドトキシンは加熱や通常のろ過では除去しにくいため、工程全体を通じた予防（破砕条件・洗浄・低エンドトキシン資材の使用）と除去（クロマト・抽出）の両面設計が現実的です。

項目可溶性発現封入体発現
破砕後の所在可溶性画分（上清）不溶性沈殿（封入体）
追加工程不要（清澄化後すぐクロマト）洗浄→可溶化→リフォールディング
変性剤の使用通常なし尿素/グアニジン（高濃度）
活性回収率一般に高い系依存・律速になりやすい
工程の長さ・コスト短い・低い長い・高い
主な律速発現量・可溶性リフォールディング収率
不純物（HCP/DNA/LPS）クロマト＋深層ろ過で除去封入体洗浄で先行低減＋クロマト

まとめ

微生物由来タンパク質の回収・精製は、(1) 遠心/膜による菌体回収、(2) 高圧ホモジナイザーによる破砕、(3) 発現形態に応じた分岐（可溶性ならそのままクロマト、封入体なら可溶化・リフォールディング）、(4) 遠心・深層ろ過による清澄化、(5) 多段クロマトによる精製、(6) HCP/DNAとエンドトキシン（LPS）の除去・規格確認、という流れで設計されます。動物細胞由来との最大の違いは、細胞内蓄積ゆえの破砕工程、封入体に伴うリフォールディング、そして大腸菌固有のエンドトキシン管理にあります。可溶性発現と封入体発現のどちらを選ぶかは収率・コスト・品質管理性を左右する設計上の重要分岐であり、上流の発現最適化と下流の精製設計を一体で検討することが、安定した品質と原価の両立につながります。なお本稿は製造・品質の技術的観点を中立に整理したものであり、特定製品の効能効果や個別メーカーの優劣を述べるものではありません。具体的な装置・消耗品の選定では、目的物の物性、スケール、規格要件に応じた検証が必要です。

参考文献

ガイドライン・基準

  • ICH Q6B: Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products（生物薬品の規格及び試験方法の設定）— 宿主由来不純物（HCP）・残存DNA等の規格設定の基本指針
  • ICH Q5A(R2): Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin — 微生物発酵には直接適用されないが、不純物クリアランス評価の考え方の参照基準
  • United States Pharmacopeia (USP) ⟨85⟩ Bacterial Endotoxins Test／日本薬局方「エンドトキシン試験法」／European Pharmacopoeia 2.6.14 Bacterial Endotoxins — LAL法等によるエンドトキシン規格試験の公定法
  • FDA Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing — Questions and Answers — 発熱性物質・エンドトキシン試験に関する規制当局の指針

主な文献

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編集メモ：この記事はProglenth編集部が、微生物・発酵に関する基礎的な情報を、はじめての方にも分かるように整理したものです。実際の製造方法・管理戦略・品質基準は、製品や企業、各国の規制によって異なります。本記事は一般的な解説であり、特定製品の推奨や規制・医療上の助言ではありません。実務で判断される際は、各極の薬局方・ガイドライン（ICH／GMP等）やメーカーの一次情報を必ずご確認ください。内容に誤りやご指摘があればお問い合わせからお知らせください。
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