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微生物・発酵基礎知識・製造工程

微生物由来タンパク質の回収・精製とは？破砕から精製まで

Proglenth 編集部公開 2026-06-14約11分で読めます

AAVやmRNA製造に使うポリメラーゼ・ヌクレアーゼ・リガーゼ——これらの酵素の多くは、大腸菌をはじめとする微生物の発酵槽から生まれています。増殖が速く培地コストが低く、高密度培養で目的タンパク質を大量に発現できる大腸菌は、酵素・サイトカイン・成長因子・抗体フラグメント全長抗体から抗原認識に必要な部分だけを取り出した分子。Fcを持たず小さく、微生物でも作れる。・ペプチド原薬など幅広いバイオ医薬の生産宿主として広く使われています。遺伝子治療・再生医療のCMC文脈でも、その存在感は増す一方です。ただし、動物細胞培養と異なり、微生物は基本的に細胞内に目的物を蓄積するため、「まず菌体を壊して中身を取り出す」という固有の前段が必要になります。そしてその先に、他の宿主にはない精製上の難所が続きます。最終的な品質は、ダウンストリーム培養液から抗体を分離・精製する下流工程。清澄化からProtein A、ポリッシュ、UF/DFまでを指す。（回収・精製）工程の設計に大きく依存します。

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微生物由来タンパク質の回収・精製とは？破砕から精製まで

菌体破砕を起点に、微生物ダウンストリームには他の宿主にはない難所がいくつか待ち構えています。まず、目的タンパク質の発現形態によって精製戦略が二分される点。可溶性画分に正しく折りたたまれて存在する場合（可溶性発現）は、菌体破砕後ただちにクロマトグラフィーへ進めます。一方、過剰発現でしばしば生じる不溶性凝集体（封入体, inclusion body）として蓄積する場合は、可溶化（変性）とリフォールディング大腸菌内で不溶性の塊（封入体）になったタンパク質を可溶化し、正しい立体構造へ巻き戻して活性を回復させる操作です。詳しく →（再生）という追加工程が必須であり、収率と活性回収率が大きな律速になります。もう一つが、大腸菌固有のエンドトキシングラム陰性菌の外膜由来の発熱性物質（LPS）で、注射剤では厳しく管理し、LAL試験などで測定します。詳しく →問題です。外膜由来のリポ多糖（LPS）は破砕液中に大量に遊離し、目的タンパク質と共精製されやすい。注射剤では発熱性物質体内に入ると発熱反応を起こす物質。パイロジェンとも呼び、エンドトキシンが代表格。として厳格な規格が課されるため、エンドトキシン除去は微生物精製の中心課題の一つです。

つまり、菌体回収・破砕、封入体の可溶化・リフォールディング、清澄化、クロマト精製、そして宿主由来不純物（HCP医薬品を作る宿主細胞に由来するタンパク質の不純物です。安全性に関わるため、精製後の残存量を測ります。詳しく →/DNA）とエンドトキシンの除去——この一連の設計が、微生物由来タンパク質の最終的な収率と純度製品にどれだけ目的物質だけが含まれ、不純物や変性体が少ないかを示す指標です。抗体では単量体の割合やサイズの異なる成分の量などを見ます。詳しく →、そして注射剤としての安全性を左右します。上流の発酵設計については微生物発酵の製造解説、封入体の取り扱いの詳細は封入体リフォールディングの解説も併せて参照してください。

この記事の要点
  • 微生物は目的物を細胞内に蓄積するため、高圧ホモジナイザーによる菌体破砕が固有の前段になります。
  • 可溶性発現か封入体発現かで精製戦略が二分され、封入体は可溶化とリフォールディングが収率の律速です。
  • HCP・宿主DNAに加え、大腸菌固有のエンドトキシン（LPS）除去が微生物精製の中心課題になります。

菌体回収と破砕：細胞内タンパク質を取り出す

発酵終了後の培養液から、まず菌体を回収します。連続式遠心分離（ディスク式遠心機高速回転する円盤で連続的に固液を分離する遠心機。培養液からの菌体回収に使う。）またはマイクロフィルトレーションによる膜濃縮が一般的で、上清（培地）と菌体を分離します。多くの微生物発現系では目的物が細胞内に蓄積するため、回収すべきは上清ではなく菌体（ペレット）側です。回収した菌体は破砕緩衝液溶液のpHを一定範囲に保つために使用される弱酸と共役塩基の混合溶液。に再懸濁し、必要に応じて洗浄して残存培地細胞を体外で生存・増殖させるために必要な栄養・エネルギー源・成長因子などを含む液体または固体の環境基盤。成分を低減します。

菌体破砕細胞内に溜まった目的タンパク質を回収するため、微生物の細胞を壊す精製の入口工程。の標準法は高圧ホモジナイザー高い圧力で試料を細い隙間に通し、その力で細胞や菌体を壊す装置です。中の目的物を取り出す破砕工程に使います。詳しく →です。高圧（典型的には数百〜1,500 bar程度）でセルを狭いバルブ間隙から噴出させ、せん断力・キャビテーション・急減圧によって細胞壁を機械的に破壊します。グラム陰性菌外膜をもつ細菌の分類。大腸菌が代表で、比較的壊しやすく外膜にエンドトキシンをもつ。である大腸菌は比較的破砕しやすい一方、酵母や一部のグラム陽性菌は細胞壁が頑強で複数回パス（通過）を要することがあります。ラボスケールでは超音波破砕やビーズミル微小なガラス・セラミックビーズと菌体を高速撹拌し、衝突・摩擦で細胞を擦り潰す破砕装置。、酵素的溶菌（リゾチーム細菌の細胞壁（ペプチドグリカン）を分解して壁を弱める酵素。菌体の酵素的溶解に使う。）も選択肢に入りますが、⁠製造スケールで再現性と処理量の両立に最も適するのは高圧ホモジナイザーであり、パス回数・圧力・温度を管理することで破砕度と発熱・断片化主鎖が切れて分子が分かれる劣化。低分子量体（LMW）として現れ、酸性側などで進みやすい。のバランスを取るのが要点です⁠。破砕は発熱を伴うため、品質劣化を避けるべく冷却と温度モニタリングが欠かせません。また、過度な破砕はDNAや微細な菌体デブリの遊離を増やし、後段の清澄化培養液から細胞や破片を取り除いて目的物質を含む上清を回収し、後工程に渡せる清澄な液にする工程です。詳しく →負荷とHCP・DNA除去負荷を高める点にも注意が必要です。

可溶性発現と封入体発現で精製戦略が分かれる

破砕後の挙動は、目的タンパク質の発現目的タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞内で転写・翻訳させ、機能的なタンパク質として産生させる工程。形態によって大きく異なります。⁠可溶性発現目的タンパク質が正しく折りたたまれ、破砕後の可溶性画分（上清）に溶けた状態で得られる発現形態。か封入体発現かが、後続の工程設計全体を規定する最初の分岐点です。

可溶性発現の場合、破砕液を遠心または深層ろ過で清澄化し、上清（可溶性画分）をそのままアフィニティーやイオン交換などのクロマトグラフィー固定相と移動相の間での物質の相互作用（分配・吸着・イオン交換など）の差を利用して、混合物中の成分を分離・精製する操作の総称。に供します。フォールディング工程が不要なため工程は短く、活性回収率も一般に高くなります。発現量と可溶性を両立させるため、発現温度の低下、強度の弱いプロモーター、シャペロン共発現折りたたみを助けるシャペロンを一緒に発現させ、可溶性発現を促す手法。、可溶化タグMBPやSUMOなど、融合して目的タンパク質の可溶性を高める配列。（MBP、SUMOMBPやSUMOなど、融合して目的タンパク質の可溶性を高める配列。、TrxMBPやSUMOなど、融合して目的タンパク質の可溶性を高める配列。など）といった上流の最適化がしばしば併用されます。

封入体発現の場合、目的物は不溶性凝集体として沈殿画分に分配されます。封入体は比較的純度が高く分解されにくいという利点がある一方、生物活性を得るには「可溶化（変性剤による分散）→リフォールディング（変性剤除去による再生）」が必須です。この追加工程が収率の主要な律速になります。可溶性タグ等の対策にもかかわらず封入体になる場合は、リフォールディング条件のスクリーニングが品質と原価の双方を左右します。封入体・可溶性いずれを採るかは、発現量、フォールディング難易度、ジスルフィド結合システイン残基どうしが作るS-S結合。タンパク質の立体構造を留める橋になる。の有無、コスト、規制上の管理性を踏まえて設計時に意思決定されます。

封入体の可溶化とリフォールディング

封入体の典型的な処理フローは、洗浄→可溶化→リフォールディング→（必要に応じ）クロマト精製です。まず封入体ペレットを低濃度の界面活性剤タンパク質の凝集や容器壁への吸着を防ぐため製剤へ少量加える添加剤で、細胞培養で細胞を保護する目的でも使われます。詳しく →やマイルドな変性剤、塩を含む緩衝液で洗浄し、膜断片・HCP・DNA・LPSなどの随伴不純物をできるだけ取り除きます。この洗浄の質が、最終のエンドトキシン・HCP規格達成に直結します。

可溶化は、高濃度のカオトロピック剤（尿素6〜8 M、塩酸グアニジン6 M程度）で凝集体を解きほぐし、ポリペプチド鎖を変性・分散させます。ジスルフィド結合をもつタンパク質では還元剤（DTT、β-メルカプトエタノール）を併用します。近年は、二次構造をある程度保ったまま分散させる「マイルド可溶化」によって、強い変性条件で起こる構造破壊や凝集を抑え、活性回収率を高める手法も報告されています（Singh et al. 2015）。リフォールディングは変性剤を希釈・透析・段階的バッファー交換などで除去し、天然構造へ巻き戻す工程です。希釈リフォールディングが基本ですが、ジスルフィド架橋を伴う場合は酸化還元対（還元型/酸化型グルタチオン酸化還元系に使う酸化型のチオール試薬。還元型グルタチオンと組み合わせ、正しいジスルフィド形成を促す。など）でレドックス環境を整え、低濃度のアルギニン分子どうしの会合による凝集を抑え、高濃度処方では粘度を下げる働きも知られるアミノ酸。などの凝集抑制剤を添加することが一般的です。リフォールディング収率は系依存性が高く、温度・pH・タンパク質濃度・変性剤残存濃度・希釈速度といったパラメータの体系的スクリーニングが鍵になります（Yamaguchi & Miyazaki 2014）。詳細は封入体リフォールディングの解説を参照してください。

清澄化とクロマトグラフィー精製

破砕液やリフォールディング液は、菌体デブリ・凝集体・微粒子を含む濁った液です。クロマトへ供する前に清澄化が必要で、製造では遠心分離比重差を利用して固形分を沈降・分離する操作。清澄化では大きな細胞塊や固形分の粗取りに使う。とデプスフィルター（深層ろ過）の組み合わせが標準的です。デプスフィルターろ材の厚み全体で不純物を捕らえる深層ろ過フィルターで、細胞培養液の清澄化など、細胞残渣や粒子を多く含む液の一次ろ過に使います。詳しく →は厚みのあるろ材内部に粒子と一部の不純物（DNA、HCPの一部）を捕捉し、後段の精密ろ過・クロマトカラムの負荷と目詰まりを軽減します。緩衝液交換や濃縮にはTFFシステム（タンジェンシャルフローろ過）が用いられ、リフォールディング後の希薄液の濃縮やバッファー交換に有効です。

精製本体はクロマトグラフィーシステムによる多段クロマトグラフィーです。捕捉（キャプチャー）にアフィニティー（Hisタグ＋IMAC、特異的リガンド等）やイオン交換、中間精製・研磨（ポリッシュ）に陰イオン交換（AEX）・陽イオン交換（CEX）・疎水性相互作用（HIC）・サイズ排除（SEC）を段階的に配置するのが代表的な構成です。重要なのは、各ステップが目的物の精製だけでなく不純物クリアランスにも寄与する点で、とくに陰イオン交換は負電荷をもつDNAとエンドトキシン（LPS）の除去に有効に働きます。フロースルー方式のAEX研磨は、目的物を素通りさせ酸性不純物を吸着させる定番のポリッシュ手段です。

宿主由来不純物（HCP/DNA）とエンドトキシン（LPS）の除去

微生物精製では、目的物の純度に加えて宿主由来不純物（HCP: host cell protein、宿主DNA）と、大腸菌に固有のエンドトキシン（LPS）の管理が品質規格の中心になります。HCPは免疫原性・酵素活性（プロテアーゼ等による分解）の観点から、宿主DNAは規制上の残存DNA規格の観点から、いずれもppm〜pg/dose水準まで低減することが求められ、ELISA（HCP）やqPCR（残存DNA）でモニタリングします。クロマト多段（とくにAEX）と深層ろ過の組み合わせで段階的にクリアランスするのが基本設計です。

エンドトキシン（LPS）は、グラム陰性菌の外膜由来のリポ多糖で、注射剤では発熱性物質として厳しく規制されます。破砕で大量に遊離し、負電荷とアシル鎖（疎水性）を併せもつため、目的タンパク質と静電的・疎水的に複合体を形成して共精製されやすい（Schneier et al. 2020）。除去戦略としては、(1) 陰イオン交換（フロースルーAEX）でLPSの負電荷を利用して吸着除去、(2) ポリミキシンB固定化アフィニティーなどLPS結合リガンドの活用、(3) Triton X-114等による相分離抽出（疎水性を利用）、(4) 限外ろ過（ただし目的物がLPSと複合体を作っていると効果が限定的）などが組み合わされます。最終製剤はエンドトキシン試験（LAL法：ゲル化法・比濁法・比色法、または組換えファクターC法）で規格適合を確認します。加熱や通常のろ過では除去しにくいため、工程全体を通じた予防（破砕条件・洗浄・低エンドトキシン資材の使用）と除去（クロマト・抽出）の両面設計が現実的です。

項目可溶性発現封入体発現
破砕後の所在可溶性画分（上清）不溶性沈殿（封入体）
追加工程不要（清澄化後すぐクロマト）洗浄→可溶化→リフォールディング
変性剤の使用通常なし尿素/グアニジン（高濃度）
活性回収率一般に高い系依存・律速になりやすい
工程の長さ・コスト短い・低い長い・高い
主な律速発現量・可溶性リフォールディング収率
不純物（HCP/DNA/LPS）クロマト＋深層ろ過で除去封入体洗浄で先行低減＋クロマト

エンドトキシン除去の具体手法：大腸菌のLPSをどう落とすか

エンドトキシン（LPS, リポ多糖）は負電荷とアシル鎖の疎水性を併せもつため、単一の原理では落としきれません。実務では性質の異なる手法を積み重ねて桁を下げていく設計が基本です。ここでは代表的な手法を、狙いと限界の両面から整理します。

陰イオン交換（AEX）フロースルーが最初に検討される定番です。目的タンパク質が中性〜塩基性で、pHを等電点より高く設定できるなら、目的物は素通り（フロースルー）させ、強い負電荷をもつLPSと宿主DNAをレジンに吸着させて分離できます。研磨（ポリッシュ）と不純物クリアランスを一手に担える効率のよさが利点です。一方、目的物が酸性でAEXに吸着してしまう場合はこの図式が崩れ、pH・塩濃度の条件検討や別手法の併用が必要になります。

Triton X-114による相分離は、LPSの疎水性を突いた抽出法です。この界面活性剤は低温で均一に溶け、温度を上げる（曇点, 約22℃以上）と界面活性剤に富む相と水相に分かれる性質をもちます。LPSは疎水的な界面活性剤相に移り、目的タンパク質は水相に残るため、遠心で相を分けるだけで大きく低減できます。低コストで強力な一方、界面活性剤の残存除去が後段の課題になります。目的物が疎水的だと一部が界面活性剤相へ道連れになる点にも注意が必要です。

エンドトキシン除去膜・フィルターは、正電荷を付与した膜やろ材にLPSを静電的に捕捉させる手法で、既存の清澄化・ろ過工程に組み込みやすいのが実務上の強みです。ただし、処理量あたりの吸着容量に上限があります。LPS負荷が高い破砕直後よりも、ある程度精製が進んだ後段の仕上げに向く手法です。

ポリミキシンB固定化アフィニティーは、LPSのリピドA部位に特異的に結合する抗生物質ポリミキシンBをリガンド化したもので、選択性の高さが持ち味です。ただし、ポリミキシンB自体の漏出（リーチング）や毒性への懸念から、原薬の最終工程よりは、LPSと複合体を作りやすい難ケースの中間精製で使われることが多いといえます。

これらはいずれか一つで完結するより、AEXで大半を落とし、膜や相分離で仕上げるといった組み合わせ設計が現実的です。共通して重要なのは、除去後にLAL法（ライセート試験）または組換えファクターC法（rFC）で実測して突き合わせることです。エンドトキシン試験の実施観点に加え、抗体医薬でのエンドトキシン管理の考え方は抗体医薬のエンドトキシン管理でも整理しています。目的物がLPSと安定な複合体を形成していると見かけの除去率が過小評価されることがあります。可能なら破砕・可溶化条件まで遡って複合体形成を抑える予防設計と、実測による検証をセットで進めるのが堅実です。

よくある質問（エンドトキシン除去）

  • 大腸菌のエンドトキシンを除去する最も一般的なクロマト手法は？ 陰イオン交換（AEX）をフロースルーで使う方法です。目的タンパク質を素通りさせ、負電荷の強いLPSと宿主DNAをレジンに吸着させます。研磨と不純物除去を同時にこなせるため、多段クロマトの仕上げ段に組み込まれることが多い手法です。

  • AEXだけでエンドトキシン規格を満たせますか？ 目的物が中性〜塩基性ならAEX単独で大きく下げられますが、注射剤の厳しい規格まで詰めるにはエンドトキシン除去膜やTriton X-114相分離、ポリミキシンBアフィニティーを併用するのが一般的です。特にLPSと目的物が複合体を作る場合は単一手法では不十分になりやすいといえます。

  • 除去できたかはどう確認しますか？ LAL法（ゲル化法・比濁法・比色法）または組換えファクターC法（rFC）で残存エンドトキシンを実測し、規格値と突き合わせます。目的物とLPSが複合体を作っていると測定値が実態より低く出ることがあるため、希釈条件（干渉因子の確認）を含めた検証が要点です。

まとめ

微生物由来タンパク質の回収・精製は、(1) 遠心/膜による菌体回収、(2) 高圧ホモジナイザーによる破砕、(3) 発現形態に応じた分岐（可溶性ならそのままクロマト、封入体なら可溶化・リフォールディング）、(4) 遠心・深層ろ過による清澄化、(5) 多段クロマトによる精製、(6) HCP/DNAとエンドトキシン（LPS）の除去・規格確認、という流れで設計されます。動物細胞由来との最大の違いは、細胞内蓄積ゆえの破砕工程、封入体に伴うリフォールディング、そして大腸菌固有のエンドトキシン管理にあります。可溶性発現と封入体発現のどちらを選ぶかは収率・コスト・品質管理性を左右する設計上の重要分岐であり、上流の発現最適化と下流の精製設計を一体で検討することが、安定した品質と原価の両立につながります。なお本稿は製造・品質の技術的観点を中立に整理したものであり、特定製品の効能効果や個別メーカーの優劣を述べるものではありません。具体的な装置・消耗品の選定では、目的物の物性、スケール、規格要件に応じた検証が必要です。

参考文献

ガイドライン・基準

  • ICH Q6B: Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products（生物薬品の規格及び試験方法の設定）— 宿主由来不純物（HCP）・残存DNA等の規格設定の基本指針 https://database.ich.org/sites/default/files/Q6B%20Guideline.pdf
  • ICH Q5A(R2): Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin — 微生物発酵には直接適用されないが、不純物クリアランス評価の考え方の参照基準 https://database.ich.org/sites/default/files/ICH_Q5A%28R2%29_Guideline_2023_1101.pdf
  • United States Pharmacopeia (USP) ⟨85⟩ Bacterial Endotoxins Test／日本薬局方「エンドトキシン試験法」／European Pharmacopoeia 2.6.14 Bacterial Endotoxins — LAL法等によるエンドトキシン規格試験の公定法
  • FDA Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing — Questions and Answers — 発熱性物質・エンドトキシン試験に関する規制当局の指針

主な文献

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編集メモ：この記事はProglenth編集部が、微生物・発酵に関する基礎的な情報を、はじめての方にも分かるように整理したものです。実際の製造方法・管理戦略・品質基準は、製品や企業、各国の規制によって異なります。本記事は一般的な解説であり、特定製品の推奨や規制・医療上の助言ではありません。実務で判断される際は、各極の薬局方・ガイドライン（ICH／GMP等）やメーカーの一次情報を必ずご確認ください。内容に誤りやご指摘があればお問い合わせからお知らせください。