ハーベスト・清澄化とは？濁度の目標とフィルターの面積はどう決めるのか

ハーベスト・清澄化とは、抗体を作らせた培養液から細胞とその破片を取り除き、抗体を含む澄んだ液（上清）を精製へ送る工程です。抗体精製の最初の工程で、精製の担当はここで、ろ過の組み方と用意するフィルターの量を決めます。

しかし、どこまで澄ませるかは清澄化の側だけでは決まらず、要るフィルターの量も培養液のロットで変わります。

濁度の目標がどこから決まり、フィルターの面積を何で見積もるのかが分かると、清澄化の試験の計画を自分で組み立てられます。

1. ハーベスト・清澄化は、培養液から何を取り除くのか

細胞、細胞の破片、液に漂う微細な粒子を取り除き、抗体を含む液だけを残します。 ハーベストは培養液を槽から回収すること、清澄化は回収した液から固形分を落として澄ませることで、2つは続けて行います。

抗体は細胞の外へ分泌されるので、欲しいものは液の側にあります。細胞の中に溜まる産物なら細胞を集めて壊しますが、抗体の工程で捨てるのは細胞のほうで、残すのは液です。

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固形分が残ったまま送ると、後ろに置く0.2 µmの孔の膜（メンブレン）が予定より早く詰まり、その次のProtein Aカラム（抗体を選んで捕まえる精製の最初の工程）でも圧力が上がります。清澄化の出来は、後ろのろ過とカラムが計画どおりに動くかを左右します。

2. なぜ、最初から細かい膜でこさないのか

細かい膜は表面で粒子を止めるため、細胞の多い培養液を通すとすぐに詰まるからです。 そこで、粗いものから順に、性質の違う段で分けて落とします。

• 遠心分離比重差を利用して固形分を沈降・分離する操作。清澄化では大きな細胞塊や固形分の粗取りに使う。詳しく →（粗取り）：遠心力で重い細胞を沈め、上清を連続して抜きます。消耗品を使わずに多くの固形分を落とせます。
• デプスフィルター（中くらいの粒子）：厚みのあるろ材の内部で粒子を捕まえます。入口側は目が粗く奥ほど細かいので、大きい粒子は手前で、小さい粒子は奥で止まります。
• 0.2 µmメンブレン（仕上げ）：最後の微粒子と、液に入った微生物（バイオバーデン）を落とします。

膜は表面だけで受け止めますが、デプスフィルターは厚み全体で受け止めるので、抱え込める固形分がずっと多くなります。この差が、段を分ける理由です。

遠心機を置くかどうかは、規模と設備で決まります。1,000 L規模の使い捨て設備を想定した評価では、デプスフィルターと0.2 µmフィルターだけの組み合わせが、ステンレスのディスク型遠心機とろ過の工程を置き換えられるとしています（Pegelら、2011年）。ろ材の素材と荷電の選び方はデプスフィルターの選び方で扱います。

3. 重要：濁度の目標は、清澄化の側だけで決めてよいのか

決まりません。後ろの0.2 µmメンブレンとProtein A抗体に特異的に結合するProtein Aを担体に固定し、抗体だけを選択的に捕まえて精製する手法です。抗体医薬の最初の精製工程として定番になっています。詳しく →カラムが、どこまで濁りを許せるかから逆算します。 澄み具合は濁度で管理し、光の散乱で測るNTUという単位で表します。

上のPegelらの評価では、出口の濁度が10 NTUを超えたろ材で後ろの0.2 µmフィルターが早く詰まり、10 NTU未満のろ材が選ばれました。詰まったろ材は処理量こそ大きかったため、そのろ材のあとに細かいデプスフィルターを重ねる組み方に変えています。

ここで迷うのが、細かいろ材を重ねるほどよいのかという点です。同じ評価では、2枚目の細かいろ材を足すと、液がさらに澄み、DNAとHCP（宿主細胞タンパク質）が減り、後ろの0.2 µmフィルターの面積も小さくなりました。一方で、抗体を失うおそれと、時間・作業の手間が増えるとしています。

ろ材でDNAやHCPがどこまで減るかも、ろ材しだいでした。DNAはある組み合わせで99%減り、HCPは、あるメーカーのろ材で30%減った一方、別のメーカーのろ材では減りませんでした。

⁠10 NTUは1つの評価での目安で、自社の後ろの工程の条件で引き直した値が合格ラインです。そのためには、Protein Aカラムの圧力上昇をどこまで許すかと、0.2 µmフィルターの面積をどれだけ取れるかを、試験の前に決めておきます。

4. フィルターの面積は、なぜ自社の培養液で測るのか

1 m²のろ材で通せる液の量が、培養液に含まれる固形分で大きく変わり、カタログの値では自社の液の分を言い当てられないからです。

面積は、小さなフィルターに培養液を通し、ろ材の前後の圧力差（差圧）が上限に届くまでに通せた量から求めます。これを処理量（L/m²）と呼び、処理したい液量を処理量で割った値が、要る面積の出発点です。

Pegelらは差圧の上限を1 barにして処理量を測りました。選んだろ材の処理量は、小規模で約105〜167 L/m²、200 Lの規模で137〜174 L/m²でした。そこから1,000 Lの培養液に要る面積を計算すると、最も小さい組み合わせで、デプスフィルターと0.2 µmフィルターを合わせて6.9 m²でした。

処理量を下げるのは、死んだ細胞と破片です。培養の期間が長く細胞の数が多いほど、それらが増えて、遠心とデプスフィルターの働きが落ちる。Burgstallerらは序論で、先行の報告を引いてこう述べています（Burgstallerら、2018年）。⁠面積の試験には平均的なロットではなく、細胞の密度が高く生存率の低い、想定する最も悪いロットを含めます。

面積が足りずに途中で詰まると、回収の途中で培養液を待たせることになり、その日の段取りが崩れます。

5. 凝集剤で面積を減らすと、何が増えるのか

加えた凝集剤が後ろの工程で除かれていることを、自社の工程で示す試験が増えます。 面積とフィルターの費用が減る代わりに、確かめることが1つ増えます。

凝集剤は、細胞と破片を大きな塊にする薬剤です。塊が大きいほど、デプスフィルターは粒子を捕まえやすく、目詰まり微粒子や凝集体、タンパク層が膜の孔を塞いでろ過が落ちる現象。プレフィルターでの前段保護が効く。詳しく →も起きにくくなります。動物細胞の表面は負の電荷を帯びているので、正の電荷を持つ高分子が使われます。

Burgstallerらは、正の電荷を持つ高分子のpDADMAC（ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド）を0.0375%加え、凝集した液向けのデプスフィルターに通しました。凝集させない標準のろ過に比べて面積は4分の1に減り、抗体の収率は97%以上、DNAは最大99%減っています。

残る凝集剤については、同じ論文がメーカーの資料を引いています。0.0375%で凝集させた場合、残ったpDADMACはProtein Aの後で10 ppm、陽イオン交換と陰イオン交換のクロマトグラフィー固定相と移動相の間での物質の相互作用（分配・吸着・イオン交換など）の差を利用して、混合物中の成分を分離・精製する操作の総称。詳しく →の後で1 ppm未満でした。この値はその資料の工程のもので、自社の工程では測り直します。後ろの精製の役割はポリッシングで扱います。

6. 自分の工程では、どの順に確かめるのか

濁度の目標を後ろの工程から決めることから始めます。 目標と試験に使うロットが決まらないと、面積も回収率も比べようがないからです。

• 濁度の目標⁠：Protein Aカラムの圧力上昇と、0.2 µmメンブレンの面積から決め、誰がどの資料で決めたかを残します。
• 試験に使うロット⁠：細胞の密度が高く生存率の低い、想定する最も悪いロットを含めます。
• 面積⁠：自社の培養液で測った処理量から出し、カタログの値のままにしません。
• ろ材の組み方と回収率⁠：細かいろ材を重ねるときは、抗体の回収率と作業時間を組み方ごとに比べます。
• 前処理の残留物⁠：凝集剤を使うなら、残った量を後ろの工程で確かめる方法を決めます。

濁度の目標か試験に使うロットが変われば、面積や回収率は測り直しです。とくに培養の条件を変えて細胞の密度や培養の期間が延びたときは、同じろ材でも処理量が下がっていないかを確かめます。

運転中ずっと上清を抜き続ける灌流培養培養液を連続的に入れ替えながら細胞を高密度に保ち、長期間生産を続ける培養方式です。細胞を装置で保持し、老廃物を除きつつ栄養を補給します。詳しく →では、清澄化の考え方が変わります。灌流の仕組みは灌流培養とは？、製品の比較はデプスフィルターとハーベスト用遠心分離機の製品ガイドで確かめられます。

参考文献

• Pegel A, Übele F, Reiser S, Müller D, Dudziak G. Evaluation of disposable filtration systems for harvesting high cell density fed batch processes. BMC Proc. 2011;5(Suppl 8):P73.
• Burgstaller D, Krepper W, Haas J, et al. Continuous cell flocculation for recombinant antibody harvesting. J Chem Technol Biotechnol. 2018;93(7):1881-1890.