灌流培養（パーフュージョン）とは？流加培養と比べて何がよく、どこでつまずくのか

灌流培養（パーフュージョン）とは、新しい培地を入れながら同じ量の培養液を抜き、細胞だけを培養槽に残し続ける培養法のことです。抗体などのバイオ医薬品抗体や組換えタンパク質など、生きた細胞や微生物に作らせる医薬品の総称です。細胞治療・遺伝子治療の製品を含めて呼ぶこともあります。化学合成で作る核酸医薬やペプチドは、ふつう含めません。詳しく →を細胞に作らせる工程の運転方式の1つで、製造の方法を決めるときに、流加培養培養の途中で栄養（フィード）を追加しながら細胞を高密度まで育てる培養方式。詳しく →（フェドバッチ、培養の途中で栄養を足していく方式）と比べられます。

ただし、細胞を濃く長く保てる代わりに、細胞を槽に残す装置と毎日の大量の培地細胞を体外で生存・増殖させるために必要な栄養・エネルギー源・成長因子などを含む液体または固体の環境基盤。詳しく →が要り、何週間も続く運転を止めずに回す体制も欠かせません。

この記事では、灌流培養の仕組み、流加培養と比べて得るものと引き受けるもの、運転でつまずく所、導入前に確かめることを順に説明します。

1. 灌流培養とは何か？

灌流培養とは、新しい培地を入れながら同じ量の培養液を抜き、細胞だけを槽に残し続ける培養法のことです。 流加培養と違い、槽の中の液を毎日入れ替えながら細胞を育てます。

流加培養（フェドバッチ）は、培養の途中で濃い栄養液を足し、10〜14日ほどで槽の中身をまとめて回収する方式です。液を抜かない。だから、細胞が出す乳酸やアンモニアグルタミンの代謝と化学分解で生じる代謝副産物。蓄積すると増殖・生存を落とし、糖鎖の質にも影響する。詳しく →のような老廃物が槽に溜まり続け、やがて細胞が弱って培養を終えます。

一方、灌流培養の槽では、培地を入れる口と培養液を抜く口が同時に働きます。抜く側には、細胞を槽へ戻し、細胞を除いた液だけを外へ通す装置が付いていて、これを細胞保持装置灌流培養で使用済みの培地を入れ替えつつ、細胞は培養槽に残すための装置です。中空糸膜などで細胞と液をより分けます。詳しく →と呼びます。抗体などの製品は、老廃物と一緒にこの液に乗って毎日外へ出ていきます。

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老廃物を流し出すと細胞は増え続けるので、増えすぎた分は細胞を培養液ごと抜いて捨てます。この操作をセルブリード（cell bleed灌流培養において、リアクター内の細胞密度を一定に保つために培養液ごと細胞を一定量抜き取る操作。詳しく →）と呼び、入れる培地、抜く液、捨てる細胞の3つを釣り合わせて細胞の濃さを一定に保った状態を、定常状態増殖と引き抜きが釣り合い、細胞密度や代謝の指標が時間で大きく動かない状態。詳しく →と呼びます。抜く量の決め方はセルブリード制御の解説で扱います。

このように、灌流培養を回すとは、培地を入れる量、液を抜く量、細胞を捨てる量の3つを毎日決め続けることです。では、液だけを抜いて細胞を残すことは、どうやって実現しているのでしょうか。

2. 細胞だけを、どうやって槽に残すのか？

細胞は、抜く側に付けた細胞保持装置が、膜でこし分けるか超音波で寄せ集めて沈めるかして液から分け、槽へ戻します。 方式は大きく次の3つです。

• TFF（タンジェンシャルフローろ過）：ストロー状の細い膜を束ねた中空糸フィルターに、ポンプで培養液を一方向に流し、膜を通り抜けた液だけを取り出します。
• ATF（交互タンジェンシャルフローろ過）：同じ中空糸フィルターの中で、ポンプで液を行ったり来たりさせます。流れが往復するため、膜の表面に溜まりかけた細胞や破片が押し戻されます。
• 音響式音響定在波で細胞を凝集・分離する、フィルタレスの細胞保持方式のこと。詳しく →⁠：膜を使わず、超音波で細胞を寄せ集めて沈め、上澄みの液だけを抜き取ります。膜が詰まる心配はありません。

TFFとATFは同じ中空糸フィルターを使い、違うのは液の流し方だけですが、その違いで膜の詰まり方と、製品が膜を通り抜ける割合が変わります（ATFとTFFの違い）。

保持装置は単体では動かず、槽の口やポンプ、制御のソフトとそろって初めて運転できます。2023年には、シングルユース使い捨ての樹脂製バッグや容器を用いる製造方式です。洗浄・滅菌の手間を減らせる一方、ステンレス設備と比べて特徴が異なり、目的に応じて選び分けます。詳しく →培養槽の制御ソフトにATFの制御を組み込んだ構成も発売され、保持装置のための制御盤を別に置かずに済む選択肢が出てきました。

つまり、灌流を始めるには、培養槽に加えて保持装置とその制御を1組でそろえる必要があります。では、そこまでして培地を入れ替え続けると、何がよいのでしょうか。

3. 培地を入れ替え続けると、何がよいのか？

培地を入れ替え続けると、老廃物を流し出せるので細胞を濃く長く保て、作った製品も槽に長くとどめずに外へ出せます。

• 槽あたりに取れる製品が増える⁠：細胞を濃く保てるぶん、同じ大きさの槽から取れる製品の量を増やせます。
• 壊れやすい製品を守りやすい⁠：流加培養では、作られた製品は培養が終わるまで温かい槽の中に置かれます。灌流では抜いた液と一緒に毎日外へ運び出されるので、壊れやすいタンパク質が槽の中で傷む時間を短くできます。

血友病の治療に使う血液凝固第VIII因子のような不安定な製品では、灌流が今も第一の選択肢とされています（Coronel J, et al. 2020）。抗体のように比較的安定な製品は流加培養で作られることが多いものの、槽あたりに取れる量を増やす目的で、灌流を使う場面が増えてきました。

細胞1個あたりの生産性まで上がるかは、別に確かめることです。灌流を模した長期の培養で流加の約2倍になったという学会発表もあり、数字の読み方は灌流は比生産性をどこまで上げるかで解説しています。

このように、灌流の利点が大きいのは、製品が壊れやすいときと、槽の容量が足りずに生産が詰まっているときです。では、その利点と引き換えに、何を引き受けるのでしょうか。

4. 流加培養と比べて、灌流培養は何を引き受けるのか？

灌流培養は、細胞を濃く長く保てる代わりに、細胞保持装置と毎日入れ替える大量の培地、そして何週間も止められない運転を引き受けます。 流加培養は運転が単純で、ロットの区切りもはっきりしているため、品質の管理を組み立てやすい方式です。

毎日の培地と、抜いた液の受け皿

灌流では、1日に槽の容量と同じくらいの培地を入れ替えることも珍しくありません。撹拌槽でATFとTFFを比べた研究でも、どちらの方式も1日に槽1杯分の液を抜く速さで運転していました（Karst DJ, et al. 2016）。槽が大きくなるほど、毎日その分の培地を作り、ろ過し、保管する段取りが要ります。

抜いた液も、毎日同じくらいの量が出てきます。精製をすぐに回さないならその液を溜める容器が要り、容器の大きさは「流れてくる液を何時間分、何日分溜めるか」から決めます。ここを詰めておかないと、流量を上げた途端に容器が足りなくなるか、精製が追いつかなくなります。

長い運転と、ロットの区切り

灌流では、長く回すほど雑菌の混入や装置の故障に出会う機会も増え、一度止まれば、何週間も続けてきた運転がそこで終わります。

長い運転のどこまでを1ロットとするかも、流加には無かった決めごとです。連続生産の国際指針 ICH Q13原薬・製剤の連続生産に関する品質・規制の考え方を整理した国際調和ガイドライン。詳しく →（2022年合意）は、付属書でタンパク質医薬の例として灌流培養の槽から精製へつながる工程を取り上げ、ロットを生産した時間や量で決める方法も示しています（連続生産とプロセス強化）。

この負担を数日に限る使い方として、本培養種培養で増やした細胞を大型の培養槽に移し、目的物質を本格的に産生させる最終段階の培養です。栄養を追加しながら育てるフェドバッチが広く使われます。詳しく →は流加のまま、一段手前の種培養少量の細胞を段階的に大きな容器へ植え継ぎ、本培養に必要な量まで増やしていく一連の種培養です。各段階で健全に増えているかを確認します。詳しく →だけを灌流にするN-1灌流もあります。

つまり、灌流を選べるかどうかは、製品の性質だけでなく、毎日の培地と受け皿を回す段取りと、長い運転を止めずに続ける体制を用意できるかで決まります。では、運転を始めたあと、細胞はどこまで濃くしてよいのでしょうか。

5. 細胞はどこまで濃くしてよいのか？

運転の目標にする細胞の濃さは、届いた最高値ではなく、セルブリード増え続ける細胞を培養液ごと系外に引き抜き、細胞密度を一定に保つ操作。詳しく →で何日も保てる濃さに置きます。 濃くするほど培養液の粘りが増し、細胞より先に、液を扱う装置の側が限界を迎えることがあるためです。

揺動式のバッグ型培養槽でTFFとATFを比べた2013年の研究では、細胞は1 mLあたり最高2.14億個（TFF）と1.32億個（ATF）まで届きました。一方で、セルブリードで2週間以上安定して保った濃さは、1 mLあたり0.9億〜1.3億個でした（Clincke MF, et al. 2013）。

最高値で止まったのは、粘りの強くなった液を、TFFでは膜が通しきれず、ATFではポンプが引ききれなくなったためです。TFFでは、液に溶けた二酸化炭素の濃さも限界の1つでした。著者らは、この細胞株では1 mLあたり1.46億個未満で運転するよう勧めています。

細胞が濃くなれば、呼吸に使う酸素も細胞の数に応じて多く要り、細胞が出す二酸化炭素も増えます（溶存酸素とkLa、pH制御とCO2）。

このように、灌流の実力は、どこまで濃くできるかではなく、決めた濃さを何週間守れるかで測ります。では、決めた濃さで回し続けると、保持装置の膜には何が起きるのでしょうか。

6. 重要：保持装置の膜は、長く回すと詰まらないのか？

膜を使う保持装置では、運転日数を重ねるほど膜に細胞の破片などが溜まり、液だけでなく製品まで通りにくくなることがあります。 製品が膜で止められると、抜いた液に出てくる量が減り、回収できる製品が少なくなります。

撹拌槽で両方式を比べた2016年の研究では、TFFでは作られた抗体の最大半分が、膜を通り抜けずに槽の側へ残りました。ATFではこれほど大きな保持は見られず、どちらの方式でも製品の品質に大きな差はありませんでした（Karst DJ, et al. 2016）。

詰まりの兆しは、次の2つを毎日の記録に入れて見ます。

• 液の通りにくさ⁠：同じ流量を抜くのに膜にかかる圧力が、日を追って上がっていないかを見ます。
• 製品の通り抜け方⁠：槽の中の製品の濃さと、抜いた液の製品の濃さを並べて記録します。槽の中は変わらないのに抜いた液の側だけが下がり始めたら、膜が製品を止め始めたと考えられます。

音響式は膜を使わないため、この詰まりは起きません。ただし、1日に処理できる液の量ごとに機種が分かれているので、目標の流量に合う大きさを選びます。

このように、膜を使う方式では、液が抜けているかだけを見ていても、製品が止められ始めたことには気づけません。

7. 自分の場合は何から確かめるのか？

自分の工程で灌流を検討するときは、灌流が要る理由から順に確かめます。

• 灌流が要る理由⁠：今の流加の記録で、培養の後半に製品の品質が落ちているなら製品を早く外へ出せる灌流に、槽の容量が足りずに生産が詰まっているなら灌流かN-1灌流に意味があります。
• 目標の細胞の濃さ⁠：届く最高値ではなく、セルブリードで何日安定して保てるかで決めます。メーカーにも、その日数を聞きます。
• 保持装置と制御⁠：保持装置が今の培養槽の口、ポンプ、制御につながるか、制御盤を別に置く必要があるかを確かめます。
• 培地・受け皿・資材⁠：毎日の培地を作り、ろ過し、保管する設備と人手が足りるかを見ます。抜いた液を溜める容器の大きさと、培地や中空糸フィルターを途切れずに調達する段取りも決めます。
• 膜の監視⁠：膜を使う方式なら、膜にかかる圧力と、槽の中と抜いた液の製品の濃さを、どの頻度で記録するかを決めます。
• ロットの区切りと記録⁠：連続した運転のどこで1ロットを区切るか、セルブリードのような運転中の操作をどう記録するかを、品質保証と早い段階で決めます。

1と2が決まれば、保持装置に通す流量や、1日に要る培地の量も見積もれます。見積もりには、細胞1個が1日に使う培地の量を表すCSPR（細胞比灌流速度細胞1個が1日に必要とする培地体積を表す指標（pL/cell/day）。灌流速度や培地消費量の設計の土台になる。詳しく →）を使います（CSPRの解説、灌流速度・培地量の計算ツール）。

候補の機種は細胞保持装置、受け皿のバッグはハーベストバッグの製品ページで比べられます。

参考文献

• Clincke MF, Mölleryd C, Zhang Y, Lindskog E, Walsh K, Chotteau V. Very high density of CHO cells in perfusion by ATF or TFF in WAVE Bioreactor. Part I. Effect of the cell density on the process. Biotechnol Prog. 2013;29(3):754–767.（TFFで最高2.14×10⁸ cells/mL、ATFで1.32×10⁸ cells/mL。セルブリードで0.9〜1.3×10⁸ cells/mLを2週間以上維持。TFFは粘度に対する膜の能力とpCO₂、ATFは粘い液を引く能力で密度が制限された。この細胞株では1.46×10⁸ cells/mL未満を推奨）
• Karst DJ, et al. Characterization and comparison of ATF and TFF in stirred bioreactors for continuous mammalian cell culture processes. Biochem Eng J. 2016.（どちらも1日に槽1杯分の抜き取りで運転。TFFで抗体が最大50%膜に保持、製品の品質に大きな差はなし）
• BioProcess International, Single-Use Devices for Alternating Tangential Flow Filtration: Highly Efficient Perfusion Processes over 50 Days（webcast recap）（50日を超える灌流の検討例）
• Coronel J, Heinrich C, Klausing S, Noll T, Figueredo-Cardero A, Castilho LR. Perfusion process combining low temperature and valeric acid for enhanced recombinant factor VIII production. Biotechnol Prog. 2020;36(1):e2915.（不安定な製品の第一の選択肢としての灌流）
• ICH医薬品規制の国際調和を目的として、日米欧の規制当局と製薬業界が参加する国際的なガイドライン策定機関。詳しく → Q13, Continuous Manufacturing of Drug Substances and Drug Products（Step 4、2022年11月16日。Annex III がタンパク質医薬の連続生産）
• Sartorius, Sartorius and Repligen Corporation launch integrated system with Biostat STR and XCell ATF for upstream process intensification（2023年8月）
• Getinge, Applikon BioSep（音響式細胞保持装置の製品情報）