エンドトキシンとは？バイオ医薬品における内毒素管理とLAL試験

ここで一つ押さえておきたいのが、エンドトキシン試験微生物そのものでなく、グラム陰性菌由来の発熱性物質エンドトキシンの量を測る試験。と無菌試験製品や細胞に細菌・真菌の汚染がないかを確認する試験。薬局方に準拠して行う。は別物だということです。無菌試験は生きた微生物が存在しないことを確認する試験であり、エンドトキシン試験はグラム陰性菌由来の内毒素が許容レベル以下であることを確認する試験です。両者は補完的であって、片方が片方を代替するものではありません。

つまり、菌がいなくても内毒素は残りうるという一点が、エンドトキシン管理を独立した課題にしています。実測には エンドトキシン測定（BET）試薬・装置 が、工程での持ち込み低減には 除菌フィルター などの部材選定が関係します。

エンドトキシンとは何か

エンドトキシンとは、主にグラム陰性菌の外膜に存在するリポ多糖（LPS）に由来する発熱性物質体内に入ると発熱反応を起こす物質。パイロジェンとも呼び、エンドトキシンが代表格。です。LPSは、脂質部分のリピドALPSの脂質部分で、エンドトキシンの発熱性に強く関与する構造。、コア多糖、O抗原多糖からなる構造を持ち、このうち発熱性に強く関与するのがリピドA部分とされています。

グラム陰性菌が増殖したり、死滅・破壊されたりすると、菌体成分としてエンドトキシンが環境中や水、原材料製造の起点となる原料で、その品質や持ち込む不純物が最終製品の品質に影響しうるため、規格管理が重視される物質。、製造設備、製品中に持ち込まれる可能性があります。エンドトキシンは熱や化学処理に対して比較的安定で、一般的な滅菌操作で微生物を殺しても完全に除去されるとは限りません。つまり、「菌が死んでいること」と「エンドトキシンがないこと」は同じではありません。

エンドトキシンは、製品中に微量でも残ると品質上のリスクになります。特に注射剤や点滴、眼内投与、髄腔内投与薬を脳脊髄液に直接投与する経路。血液脳関門を回避して中枢神経系へ核酸などを届ける。など、体内に直接入る製品では、エンドトキシン管理が重要になります。投与経路による管理の厳しさの違いは、後述する限度値（K値投与経路ごとに定められた体重あたりの許容エンドトキシン量であり、製品の規格値算出の基礎となる。）の考え方に直結します。

エンドトキシンは工程由来の安全性リスクとして扱う

エンドトキシンは、抗体そのものが変化して生じる不純物ではありません。抗体医薬における凝集体、断片、電荷異性体、糖鎖バリアントなどは、抗体そのものの変化（製品由来不純物目的物質そのものの変化体（凝集体・分解物など）を指し、製造工程に由来する工程由来不純物とは区別して管理します。詳しく →）として扱われます。一方、エンドトキシンは、微生物由来の汚染・工程由来の安全性リスクとして扱います。不純物の分類については 不純物の種類 の整理もあわせて参照してください。

エンドトキシンは、HCPや残存DNAのように製造工程から持ち込まれる可能性がある一方で、微生物管理や製造環境、用水、原材料管理とも強く関係します。そのため、単に「最終製品で試験する」だけでなく、製造用水、バッファ、原材料、容器、シングルユース使い捨ての樹脂製バッグや容器を用いる製造方式です。洗浄・滅菌の手間を減らせる一方、ステンレス設備と比べて特徴が異なり、目的に応じて選び分けます。詳しく →部材、工程中間体ゲノムを途中までしか積んでいないAAVカプシド。空でも実でもない中間的な粒子で、測定時にどちらへ数えるかで比率が動く。などの管理も重要になります。抗体医薬の全体像は 抗体医薬の工程フロー で工程ごとに確認できます。

なぜエンドトキシンを管理するのか

エンドトキシンを管理する理由は、製品中に残ったエンドトキシンが患者に投与された場合、発熱反応などの安全性リスクにつながる可能性があるためです。特に注射剤では、消化管を通らずに体内へ直接入るため、エンドトキシン管理が厳しく求められます。

エンドトキシン管理で見るべき観点は、次のように整理できます。

エンドトキシンは、微生物が増殖できる環境や、水系の工程と関係しやすい項目です。バッファ調製、製造用水、ろ過工程、容器・チューブ・バッグ、シングルユース部材、原材料の保管や取り扱いなど、製造工程全体で管理します。水系での持ち込みを抑える観点では、除菌フィルター や メンブレンフィルター の選定・完全性試験除菌フィルターに欠陥がなく所定の孔径を保っているかを確認する試験。無菌ろ過の信頼性を裏づける。もエンドトキシン管理の一部として位置づけられます。

エンドトキシン限度値（K値）の考え方

製品ごとのエンドトキシン限度値は、一般に「K / M」という考え方で算出されます。Kは投与経路ごとに定められた、体重あたりの許容エンドトキシン量です。代表的には、静脈内投与で 5 EU/kg、髄腔内投与で 0.2 EU/kg が用いられます（K は体重あたりの閾値発熱性用量であり、「1時間あたり」はエンドトキシン限度の M の側の定義に含まれます）。Mは、患者体重あたりの最大1時間投与量です。

同じ測定値（EU/mL）でも、製品濃度、1回投与量、投与経路によって適合・不適合の判断は変わります。⁠エンドトキシン評価は、測定値そのものではなく、製品ごとの限度値とセットで判断する ことが基本です。

LAL試験とは何を見る試験か

エンドトキシン試験（BET：Bacterial Endotoxins Test製品中のエンドトキシンを検出・定量するバクテリアエンドトキシン試験の総称。）で代表的に使われるのが、LAL試験です。LALは Limulus Amebocyte Lysate の略で、カブトガニ由来のアメーバ様細胞（血球）抽出物を利用した試験です。エンドトキシンが存在すると、LAL試薬中の凝固カスケード（Factor CLAL反応カスケードの最上流に位置するセリンプロテアーゼで、エンドトキシン（LPS）またはβ-グルカンによって活性化される酵素（因子C・因子Gを介した活性化を受ける）。 → Factor B → 凝固酵素前駆体）が活性化T細胞を抗原刺激や人工的な刺激試薬で活性化し、増殖・機能発揮できる状態に誘導する操作。され、最終的にゲル化、濁度変化、発色反応などとして検出されます。

LAL試験には、主に次のような方法があります。実測の試薬・装置は エンドトキシン測定（BET）試薬・装置 として整理しています。

比濁法・比色法では、反応速度から濃度を読むため、マイクロプレートリーダー などの測定機器とソフトウェアで標準曲線を作成し、定量します。

USP <85> は、バクテリアエンドトキシン試験に関する薬局方試験法として位置づけられており、ゲル化法・比濁法・比色法がエンドトキシンの検出・定量に用いられます。USPはさらに、組換え試薬を用いる <86> を整備し、公式化を進めています。

LAL試験で得られる結果は、一般に EU/mL や EU/mg などの単位で表されます。EUは Endotoxin Unit の略で、エンドトキシン活性を表す単位です。標準品（CSE：管理標準エンドトキシン）を、参照標準（RSE）に対して校正したうえで使用します。

エンドトキシン試験と無菌試験は何が違うのか

エンドトキシン試験と無菌試験は、どちらも微生物関連の品質試験ですが、見ているものが違います。無菌試験は、生きた微生物が存在しないことを確認する試験です。培地に接種し、一定期間培養して、細菌や真菌の増殖の有無を確認します。一方、エンドトキシン試験は、グラム陰性菌由来の内毒素が製品中に残っていないか、または許容範囲内かを確認する試験です。

ここで重要なのは、無菌試験で問題がなくても、エンドトキシンがゼロとは限らないという点です。微生物が死滅していても、菌体成分としてエンドトキシンが残る可能性があります。逆に、エンドトキシン試験だけでは、生きた細菌や真菌の有無は分かりません。

そのため、注射剤やバイオ医薬品の品質評価では、エンドトキシン試験、無菌試験、バイオバーデン試験を目的に応じて組み合わせます。無菌性の試験設計や 無菌試験 の考え方は、無菌試験の分析 でさらに掘り下げています。

エンドトキシン試験で注意する干渉と回収

エンドトキシン試験では、サンプルの成分が反応を妨げたり、逆に反応を強めたりすることがあります。これを干渉（interference）と呼びます。バイオ医薬品では、タンパク質濃度、塩濃度、pH、界面活性剤、キレート剤（二価カチオンを奪う成分）、添加剤、バッファ成分などがLAL反応に影響する場合があります。

そのため、エンドトキシン試験では、単にサンプルを測定するだけでなく、反応阻害や反応促進がないことを確認する必要があります。この確認を、干渉因子試験（インヒビション／エンハンスメント試験）と呼びます。

干渉が見られる場合は、適切な希釈（MVD：最大有効希釈率の範囲内での希釈）、pH調整、適切な分散剤の使用などで克服します。希釈は最も一般的な対処ですが、希釈しすぎると検出感度（λ：標識感度）を下回るため、MVDを超えない範囲で設計します。

FDAのエンドトキシン・パイロジェン試験Q&Aでは、試験結果に矛盾や問題がある場合、USP <85> の解釈や再試験の考え方を参照することが示されています。抗体医薬では、タンパク質濃度が高いサンプルや、界面活性剤（ポリソルベートなど）を含む製剤で、試験干渉の確認が特に重要になります。

エンドトキシンはどこから入るのか

エンドトキシンは、製造工程のさまざまな場所から持ち込まれる可能性があります。特に水系の工程、原材料、容器、設備、シングルユース部材、作業環境が重要です。

エンドトキシンは、一度持ち込まれると後工程で完全に除去するのが難しい場合があります。除菌フィルター（0.2µm）は微生物（菌体）を除去しますが、遊離したLPS分子そのものは通過し得るため、フィルターは「持ち込みを防ぐ」ための手段であってエンドトキシン除去手段ではない、という理解が重要です。そのため、最終製品での試験だけに頼るのではなく、持ち込みを防ぐ設計が重要になります。

具体的には、低エンドトキシン原材料の使用、WFIや製造用水の管理、デパイロジェン処理（一般に 250℃・30分以上などの乾熱処理）済み容器の使用、適切な洗浄・滅菌、保持時間（ホールドタイム）管理、除菌フィルター やシングルユース部材の選定などが関係します。

抗体医薬の工程でエンドトキシンを見るポイント

抗体医薬の製造工程では、エンドトキシンは主に工程由来・環境由来の汚染リスクとして管理します。CHO細胞を使った抗体医薬の工程では、培養、清澄化、Protein A精製、ウイルス不活化、ポリッシング、UF/DF、製剤化、ろ過、充填などの工程があります。各工程の流れは 抗体医薬の工程フロー で確認できます。

エンドトキシン管理では、特に水、バッファ、原材料、容器、工程中の保持条件が重要です。

エンドトキシンは、HCPや残存DNAのように「精製で段階的に下げる」という面もありますが、基本的には 持ち込ませないこと が重要です。特に後工程や製剤化後にエンドトキシンが混入すると、除去の選択肢が限られるため、工程全体で予防的に管理します。ウイルスを物理的・化学的に除去する ウイルスクリアランス と異なり、エンドトキシンは「クリアランス工程で確実に落とす」前提では設計しにくい点に注意が必要です。

DSとDPでエンドトキシン評価の意味は変わる

エンドトキシン評価は、DSとDPで意味が変わります。DSは Drug Substance、つまり原薬です。DPは Drug Product、つまり製剤です。

DSでは、エンドトキシン評価は、製造工程を通じてエンドトキシンが管理されているか、原薬として次工程に進められる状態かを確認する意味を持ちます。DPでは、最終製品として患者に投与される前提で、製品ごとのエンドトキシン限度値に適合しているかを確認する意味が強くなります。

DPでは、投与量や投与経路に応じたエンドトキシン限度値（前述のK/Mの考え方）が重要になります。同じ EU/mL という結果でも、製品濃度、投与量、1回投与量、投与経路によって意味が変わります。そのため、エンドトキシン評価では、単なる測定値だけでなく、製品ごとの限度値とセットで判断します。

LAL試験と組換え試薬法

従来のエンドトキシン試験では、カブトガニ由来のLAL試薬が広く使われてきました。近年では、動物由来原料を使わない組換え試薬法も整備が進んでいます。代表的には、rFC（recombinant Factor C）やrCR（recombinant cascade reagent）などがあります。

rFCは凝固カスケードの最上流である Factor C のみを組換えで再現した試薬で、エンドトキシン特異性が高く（グルカンによる偽陽性を受けにくく）、蛍光で検出するのが一般的です。rCRは Factor C・Factor B・凝固酵素前駆体までを組換えで再構成したもので、従来のLALに近い発色反応で検出できます。

USPは、組換え試薬を用いるバクテリアエンドトキシン試験として <86> を整備しており、rFCやrCRを含む組換え試薬による試験法が薬局方上でも位置づけられつつあります。

ただし、採用にあたっては、既存法との比較、バリデーション（方法の同等性評価）、規制要件、製品特性、試験目的を整理する必要があります。動物福祉（カブトガニ資源の保護）の観点からも組換え試薬への移行は注目されていますが、製品ごとに適用可能性とリスクを評価したうえで導入するのが基本です。

低エンドトキシン回収（LER）はなぜ起きるのか

エンドトキシン試験の干渉というと、多くはサンプルを希釈すれば消える「その場の反応阻害」を指します。ところが、界面活性剤とキレート剤を組み合わせた製剤では、測定した瞬間には問題がなくても、⁠時間が経つにつれて添加したエンドトキシンが検出できなくなっていく という、もうひとつの現象が知られています。これが低エンドトキシン回収（LER：Low Endotoxin Recovery）です。

鍵になるのは、エンドトキシン（LPS）が水中では単分子ではなく、二価カチオン（マグネシウムやカルシウム）を橋渡し役として大きな会合体をつくっている、という点です。ここにポリソルベート80などの界面活性剤とクエン酸ナトリウムなどのキレート剤が共存すると、キレート剤が二価カチオンを奪って会合体をほどき、界面活性剤がほどけたLPS分子を包み込む——というかたちで、リピドA部分がLAL試薬や組換え試薬から「見えなく」なると考えられています。つまり菌体成分が消えたわけではなく、⁠発熱性の中心が試薬に認識されない状態に隠される（マスキング） のがLERの正体です。

問題は、この現象がバイオ医薬品でよく使われる処方——タンパク質の安定化にポリソルベート、pH調整・緩衝にクエン酸——とちょうど重なることです。しかも通常の添加回収（スパイク回収）は調製直後に測るため、そのタイミングでは回収率が正常に見え、干渉を見逃してしまいます。

ホールドタイム試験と対策

LERを見つけるための考え方が、ホールドタイム試験（保持時間試験）です。標準エンドトキシンを実際の製剤マトリックスに添加し、規定の温度で一定期間（一般に室温や冷蔵で数日〜規定期間）保管しながら、複数の時点で回収率を追います。ある時点から回収率が下がり、目安とされる50〜200%の範囲を割り込むようなら、その処方はLERを起こしていると判断します。単発の回収試験ではなく、⁠時間軸に沿って回収率が保たれるかを見る のがホールドタイム試験の眼目です。

対策は製剤設計と試験法の両面から検討します。試験法側では、二価カチオンを補ってLPSの会合状態を戻す分散剤（マグネシウム塩を含む前処理液など）を用いる、加温・分散処理を加える、といったサンプル前処理が試されます。処方側では、界面活性剤やキレート剤の種類・濃度の見直しが選択肢になりますが、これらは製剤の安定性そのものを担う成分なので、製剤設計の考え方 と品質のバランスの中で判断することになります。LERはあくまで「試薬に見えにくくなる」現象であって、除菌ろ過 のようにエンドトキシンを物理的に除く工程とは別の問題である点にも注意が必要です。

なお、rFC（組換えFactor C）などの動物由来代替法でもLERは起こり得ます。LERの本質は試薬の由来ではなくLPSの会合状態の変化にあるため、rFC・rCRへ切り替えても自動的に解決するわけではなく、採用する試薬ごとにホールドタイム試験で確認しておくのが実務的です。

まとめ

エンドトキシンは、主にグラム陰性菌の外膜に由来するLPS関連成分であり、注射剤やバイオ医薬品では重要な安全性管理項目です。菌が死滅していても発熱性をもったまま残り得るため、無菌試験とは別の試験として管理します。

エンドトキシン試験ではLAL試験が広く使われ、ゲル化法・比濁法・比色法があり、近年ではrFCやrCRなどの組換え試薬法も整備されつつあります。測定値（EU/mL）は、製品ごとの限度値（K/Mの考え方）とセットで判断します。

抗体医薬の工程では、エンドトキシンは主に用水、原材料、容器、設備、バッファ、工程中汚染から持ち込まれます。除菌フィルターは菌体を除去しても遊離LPSは通過し得るため、最終製品で測るだけでなく、工程全体で持ち込ませない設計が重要です。

DSでは原薬として工程由来のエンドトキシン負荷が管理されているか、DPでは最終製品として投与時のエンドトキシン限度に適合しているかを確認します。エンドトキシンを理解することは、LAL試験の原理を知るだけでなく、製造用水、原材料、微生物管理、無菌性、バイオバーデン、製剤規格をつなげて読むことでもあります。

参考文献

• USP <85>: Bacterial Endotoxins Test.
• USP <86>: Bacterial Endotoxins Test Using Recombinant Reagents.
• USP: Expert Committee approves endotoxin testing using non-animal-derived reagents.
• USP: Use of recombinant animal-free reagents in the bacterial endotoxins test.
• FDA: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers.
• ICH Q4B Annex 14: Bacterial Endotoxins Tests, General Chapter.
• 日本薬局方: エンドトキシン試験法（一般試験法）.