無菌・微生物（バイオバーデン）とは？

手法の比較 ― どの方法で測るか

手法	原理	何が分かる	使い分け
無菌試験（メンブレン法）	ろ過後に培地で培養し生菌を検出	無菌性（陰性/陽性）	最終製品の無菌性
エンドトキシン試験（LAL/rFC）	凝固・比色で内毒素を測定	エンドトキシン量（EU/mL）	発熱性物質の管理
マイコプラズマ試験	培養法・核酸増幅法（NAT）	マイコプラズマの有無	セルバンク・中間体
迅速無菌試験（呼吸/CO2ベース、USP <72>）	菌の代謝で生じるCO2を培地底部の比色センサで検出。bioMérieux BacT/ALERT 3D（iFN Plus 37℃・iFA Plus 32℃）が代表。2025年8月にUSP <72>として正式収載（適用はモノグラフ等での引用が要件）	汚染陽性／陰性（連続モニタリング）。基準法より短時間で検出（文献では平均TTP 34h対USP <71> 50h, PMID 30541938）	細胞・遺伝子治療（ATMP）、調製無菌製剤、放射性医薬品など14日を待てない短寿命製品の迅速出荷判定
迅速無菌・バイオバーデン（ATP生物発光、USP <73>）	メンブレンろ過で捕集した生菌のATPを生物発光で定量検出。Merck Milliflex Rapid System 2.0、細胞含有検体はCelsis Adapt。液体培養＋目視を固形培地＋自動発光検出に置換し約5日で結果	生菌の有無（無菌試験）／CFU相当（バイオバーデン）	短寿命のATMP出荷試験、工程中バイオバーデンの迅速モニタリング
バイオバーデン（微生物限度・計数、USP <61>/<62>）	検体をメンブレンろ過または直接平板法で培養し、好気生菌数（TAMC）・真菌数（TYMC）を計数。USP <62>で特定菌（E. coli, Salmonella等）の有無を確認。3薬局方調和	TAMC（CFU/g・mL）、TYMC（CFU/g・mL）、特定菌の陰性／陽性	無菌ろ過前の工程中間体、原料、用水、最終非無菌製品の菌負荷管理

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現場の基準 ― 装置・パラメータ

★ 代表的な基準法無菌試験：メンブレンフィルトレーション法（USP <71> / Ph.Eur. 2.6.1 / JP 4.06、FTM＋SCDMの2培地で14日間培養）

代表的な装置・ベンダー

自動無菌試験用アイソレータ／クローズドシステム（Steritest）Sartorius Sterisart / Merck Millipore Steritestシリーズ（クローズド型メンブレンろ過ユニット）Sartorius, Merck (Millipore)
呼吸（CO2）ベース迅速無菌検出（USP <72>、ATMP・短寿命製品向け）bioMérieux BacT/ALERT 3D（iFA Plus／iFN Plusボトル、CO2比色検出）bioMérieux
ATP生物発光ベース迅速無菌・バイオバーデン（USP <73>）Merck Milliflex Rapid System 2.0（Milliflex Oasis膜、細胞含有検体はCelsis Adapt）Merck (Millipore)
バイオバーデン（メンブレンろ過によるCFU計数：TAMC/TYMC）Sartorius Microsart / Merck Milliflex Oasis（マニホールド＋膜カートリッジ）Sartorius, Merck
血液培養型自動微生物検出（無菌試験代替の比較対照に用いられる）BD BACTEC FX / bioMérieux BacT/ALERT Dual-TBD, bioMérieux

主な管理パラメータ

培養期間：無菌試験は14日以上（USP <71>/Ph.Eur. 2.6.1）。バイオバーデンはTAMC 3–5日、TYMC 5–7日培地・温度：FTM 30–35℃（嫌気・好気菌）、SCDM/TSB 20–25℃（好気菌・真菌）。バイオバーデンはSCDA 30–35℃／SDA（Sabouraud）20–25℃メンブレン孔径：0.45μm。検体ろ過後に各培地へ膜を分割移送培地適合性（Bacteriostasis/Fungistasis、B/F試験）：製品の発育阻害がないことを試験前に実証培地の発育促進試験（GPT）：規定6菌株を≤100 CFUで接種し、細菌<3日・真菌<5日で発育確認検体量・容器数：USP <71> Table 2/3に基づき、ロットサイズと製品形態で抜取容器数・最少採取量を規定迅速法の管理：BacT/ALERT 3Dの培養温度（iFN Plus 37℃／iFA Plus 32℃）、Milliflex Rapidの検出時間陰性／陽性対照、環境モニタリング（隔離環境での試験実施による偽陽性抑制）

出典USP <71>USP <61>USP <1111>USP <72>Ph.Eur. 2.6.1ICH Q4B Annex 8(R1)21 CFR 610.12PMID 30541938

許容基準・別の方法での確認・落とし穴を見る

なぜこれが基準法か

3薬局方がICH Q4B Annex 8(R1)で調和済みの代表的基準法。製品を孔径0.45μm膜でろ過し菌体を捕集後、流動チオグリコール酸培地（FTM、30–35℃、嫌気・好気菌）とソイビーンカゼイン消化培地（SCDM/TSB、20–25℃、好気菌・真菌）に移して14日以上培養する。直接接種法より阻害物質（抗菌剤・防腐剤）を洗い流せるため第一選択。生物製剤は21 CFR 610.12で各ロットの無菌性が義務付けられる。バイオバーデン（工程中間体・原料・用水の生菌数）はUSP <61>（TAMC/TYMC）が基準法。

典型的な許容基準・規格

無菌試験：14日間の培養で発育（混濁）が認められないこと＝適合（USP <71>／Ph.Eur. 2.6.1／JP 4.06、ICH Q4B Annex 8(R1)で調和）。生物製剤は21 CFR 610.12で各ロット試験が義務。発育促進試験は≤100 CFU接種で対照に対し50%以上の回収、細菌<3日・真菌<5日で発育確認。バイオバーデン：製品種別ごとにUSP <1111>で規格を設定（例：経口固形剤 TAMC ≤10^3 CFU/g、TYMC ≤10^2 CFU/g、E. coli陰性）。規格値10^n CFUは最大許容で10^1→20、10^2→200、10^3→2000と解釈。回収率は接種量の50–200%（2倍以内）を許容。EU GMP Annex 1は短寿命製品で迅速／代替法の使用を推奨。

別の方法での確認

無菌性は単一試験に依存せず多層で確認する。(1) 工程の無菌保証：培地充填試験（メディアフィル）、環境モニタリング（USP <1116>/Annex 1）、滅菌バリデーション。(2) 工程中間体・原料・用水のバイオバーデン（USP <61>/<62>）で無菌ろ過前の菌負荷を管理。(3) エンドトキシン試験（LAL／rFC、USP <85>/Ph.Eur. 2.6.14）で死菌由来の発熱性物質を別途確認。(4) マイコプラズマ試験（USP <63>/Ph.Eur. 2.6.7、培養法＋NAT）で無菌試験では検出できない無細胞壁菌を確認。(5) 迅速法導入時は基準法（USP <71>）との並行試験で検出感度（菌株パネル）と検出時間を同等性検証。発育促進試験では規定6菌株（S. aureus ATCC 6538, B. subtilis ATCC 6633, P. aeruginosa ATCC 9027, C. sporogenes ATCC 19404, C. albicans ATCC 10231, A. brasiliensis ATCC 16404）で培地性能を別の方法での確認する。

よくある落とし穴と対処

製品の抗菌・防腐成分や界面活性剤、抗生物質で接種菌の発育が阻害され偽陰性となる事前にB/F（bacteriostasis/fungistasis）試験で適合性を実証。膜を希釈液（ペプトン水等）で十分洗浄し阻害物質を除去、または中和剤を添加してメンブレン法を採用する
無菌試験は14日と長く、ATMP・細胞治療など短寿命製品では結果を待てないUSP <72>（呼吸/CO2ベース、BacT/ALERT 3D）やUSP <73>（ATP生物発光、Milliflex Rapid）等の迅速法を導入。ただし監視製品でも当該迅速法は適用前にモノグラフ／General Notices等での引用が必要
操作者・環境由来汚染による偽陽性で不必要なロット廃棄や逸脱調査が発生アイソレータ／クローズドシステム（Sterisart・Steritest）で試験し環境曝露を最小化。陰性対照と環境モニタリングを並行、無効試験の判定基準を手順に明記する
無菌試験は抜取試験であり、低汚染率のロットを統計的に保証できない（検出限界）工程の無菌保証（PUPSIT・培地充填バリデーション・環境モニタリング・バイオバーデン管理）と組み合わせて全体で保証。最終製品試験単独に依存しない
培地の品質不良で発育が支持されず偽陰性となる使用培地ロットごとに規定6菌株（後述）で発育促進試験を実施。回収率と発育時間の合格基準を満たした培地のみ使用する

こんな場面で使う