純度・凝集体

SEC-HPLC（サイズ排除クロマトグラフィー）

SEC-HPLCは、分子の流体力学的サイズの違いで分離するサイズ排除クロマトグラフィーをHPLC/UPLCで行う分析手法です。抗体などの凝集体（HMW）、モノマー、断片（LMW）を保持時間で分け、UV検出のピーク面積から各成分の比率を算出します。原薬・製剤の純度評価や安定性試験の代表的な指標として、QC試験や工程開発で広く使われています。

凝集体（HMW）評価純度・モノマー含量保持時間・分離度安定性試験

分類: 純度・凝集体
主な用途: 凝集体（HMW）評価 / 純度・モノマー含量 / 保持時間・分離度 / 安定性試験
関連モダリティ: 抗体医薬 / 二重特異性抗体 / ADC / Fc融合・組換えタンパク質 / ワクチン / mRNA-LNP
代表メーカー: Agilent・Waters・Tosoh Bioscience・Thermo Fisher Scientific ほか計9社
関連キーワード: 凝集体分析 / 純度分析 / モノマー含量 / AUC / SEC-MALS / CE-SDS

用途・特徴

SEC-HPLCは、孔径が制御された多孔質粒子を充填したカラムに移動相を流し、分子を大きさの順に分離する手法です。大きい分子ほど粒子内部の孔に入りにくく早く溶出し、小さい分子ほど遅れて溶出します。これにより、凝集体（HMW）、モノマー、断片（LMW）を一度の測定で分けて確認できます。

検出は主にUV（280nm付近）で行い、得られたクロマトグラムのピークを積分して各成分の面積%を求めます。等張に近い塩濃度の移動相を一定流速で送液する分離モードのため、勾配をかけるイオン交換などと比べて操作はシンプルで、ランごとの再現性を取りやすいのが特徴です。

近年はBEH系などの小粒子カラムをUPLC装置で使う高速・高分離度の構成が増えており、絶対分子量を求めたい場合はMALS検出器を連結したSEC-MALSへ拡張できます。手法・カラム・装置・データ解析ソフトを組み合わせた製品群として運用されます。

Point

凝集体（HMW）・モノマー・断片（LMW）をサイズで分けて定量できる
ピーク面積からモノマー含量や凝集体%を算出する
安定性試験で凝集・断片化の経時変化を追跡しやすい
等濃度溶離（アイソクラティック）で操作・再現性を取りやすい
保持時間・分離度・理論段数などでシステム適合性を確認する
UV検出が基本で、絶対分子量はMALS連結（SEC-MALS）で補える
移動相の塩濃度やpHで非特異吸着・分離挙動が変わる
希釈や移動相条件で可逆的な凝集解離が起こる場合がある

使用方法

基本的には、目的に合うSECカラムと移動相を選び、システムを平衡化・適合性確認したうえでサンプルを注入し、クロマトグラムからHMW/モノマー/LMWを積分して比率を算出します。

1カラム孔径・粒子径と移動相を選定する

2移動相でカラムを平衡化する

3標準品でシステム適合性を確認する

4サンプルを規定濃度・量で注入する

5一定流速でクロマトグラムを取得する

6保持時間でHMW/モノマー/LMWを帰属する

7各ピークを積分する

8面積%（モノマー含量・凝集体%）を算出する

9判定基準と照合し合否を判断する

10カラム洗浄・保管と記録を行う

実際の条件は、対象分子のサイズ、カラムの孔径・粒子径、移動相のpH・塩濃度、流速、注入量・濃度、検出波長、装置の流路材質（非特異吸着）によって変わります。可逆的な凝集解離や非特異吸着が疑われる場合は、移動相条件や注入量を振って確認します。

SEC-HPLCとAUC（沈降速度法）の違いは？

SEC-HPLCとAUC（分析超遠心・沈降速度法）は、いずれも凝集体やサイズ分布を評価できますが、原理・スループット・希釈の影響が異なります。

結論

SEC-HPLCは「カラムで素早くサイズ分離して日常的に凝集体・純度を測る方法」、AUCは「希釈や担体の影響を受けにくく、SECの結果を確認・補完する別の方法」と整理すると使い分けやすくなります。

分離原理

溶液中の沈降速度（質量・形状）

カラム孔への入りやすさ（流体力学的サイズ）

固定相・担体

担体なし（溶液中で測定）

多孔質粒子カラムを使用

希釈・吸着の影響

受けにくい

カラム上の希釈・非特異吸着の影響を受けうる

スループット

1検体あたり時間がかかる

短時間・多検体に向く

主な出力

沈降係数分布（c(s)）

クロマトグラム、面積%

主な用途

別の方法での確認、メソッド検証

リリース試験、工程内管理、安定性試験

位置づけ

確認・補完の別の方法

日常的なルーチン分析の中心

SEC-HPLCの選定軸

対象分子のサイズや求める分離度、運用条件に応じて、カラム・装置・移動相・ソフトを選びます。

カラム孔径対象分子のサイズに合う孔径か（抗体・凝集体まで分けられるか）

粒子径2〜3µm（UPLC向け）か5µm前後（HPLC向け）か。分離度と圧力のバランス

UPLC vs HPLC高分離度・短時間のUPLCか、汎用性・既存資産のHPLCか

移動相リン酸塩などの緩衝液・pH・塩濃度。非特異吸着を抑えられる組成か

装置の不活性化バイオイナート流路で金属への吸着・キャリーオーバーを抑えられるか

検出器UVが基本。絶対分子量はMALS、微量成分は蛍光を併用するか

分離度HMW/モノマー/LMWを基準どおりに分けられる分離度が得られるか

スループット1検体あたりの分析時間と検体数の見合い

ソフト・CSV対応Empower/OpenLab/Chromeleon等。監査証跡・データ完全性に対応できるか

カラム寿命注入回数・洗浄頻度に対する寿命とロット間差

標準品システム適合性・帰属に使う標準品（分子量マーカー等）の入手性

再現性保持時間・面積%のラン間・装置間のばらつき

測定する主な項目

サイズの違いに基づき、凝集体からモノマー、断片までを分けて評価します。

項目	内容	主な指標
HMW凝集体	モノマーより大きい高分子量成分（多量体・凝集体）	凝集体%（面積%）
二量体	モノマー2分子からなる成分。HMWの一部として評価	二量体%
モノマー	目的分子の単量体。主ピーク	モノマー含量（%）
LMW断片	モノマーより小さい分解物・断片	断片%（面積%）
保持時間	各ピークの溶出時間。帰属と再現性の確認に使う	保持時間（分）
分離度	隣接ピークの分かれ具合	分離度（Rs）

主な注意点

結果の妥当性を保つため、吸着・希釈・適合性の確認が重要です。

注意点	内容
非特異吸着	カラム充填剤や流路へ分子が吸着すると回収率・面積%がずれる。移動相・流路材質で抑える
移動相の塩濃度	塩濃度・pHが分離挙動と非特異相互作用に影響する。組成を一定に保つ
濃度依存性	注入濃度・量により凝集体の見え方やピーク形状が変わる場合がある
可逆的な凝集解離	希釈や移動相条件で凝集体が解離・形成し、実態と異なる結果になりうる
システム適合性	保持時間・分離度・理論段数などを毎回確認し、基準を満たすことを担保する
カラム寿命・差	使用回数やロットで分離が変化するため、定期的に適合性を確認する