大腸菌・酵母・糸状菌の選び方とは？ジスルフィドと糖鎖で絞る

カビの仲間である糸状菌 Trichoderma reesei の工業株は、自前のセルラーゼを培養液1 Lあたり100 gの桁まで分泌すると報告されています。宿主の分泌量を並べた表なら、断然の一位です。

ところが、同じ菌にヒト由来のタンパク質を作らせると、発現量細胞が目的のタンパク質を作る量。低いと必要量の確保に手間がかかり、製造コストが上がる。詳しく →はたいてい伸びません。⁠先に効くのは分泌量ではなく、そのタンパク質が要求する共有結合の修飾（ジスルフィド結合とN型糖鎖タンパク質に付加される糖の鎖状構造で、抗体の有効性・免疫原性などに影響する重要な品質特性。詳しく →）を、宿主の細胞内環境が組めるかどうかです。

ただし、答えは条件で変わります。この記事では、大腸菌の細胞質でジスルフィド結合が組めない理由、外膜のリポ多糖が注射剤の工程設計を変える場所、酵母の高マンノース型糖鎖酵母が付けるマンノースの多い糖鎖。ヒト型と異なり、活性・半減期・免疫原性や均一性で医薬用途の制約になる。詳しく →の限界、宿主を替えると作り直しになるものを、決める順で説明します。

1. 分泌量の一位が、ヒトのタンパク質では伸びない

宿主の比較は、速さや安さから始めたくなります。けれども最初に決まるのは、そのタンパク質をそもそも正しい形で作れるかどうかです。

見る軸は二つあります。作りたいタンパク質が要求する翻訳後修飾（ジスルフィド結合システイン残基どうしが作るS-S結合。タンパク質の立体構造を留める橋になる。詳しく →とN型糖鎖）と、注射剤にするために許せる下流の負荷（エンドトキシングラム陰性菌の外膜由来の発熱性物質（LPS）で、注射剤では厳しく管理し、LAL試験などで測定します。詳しく →、封入体のリフォールディング、宿主由来の不純物）です。

糖鎖がヒト型である必要があるタンパク質は、この三つとも候補から外れます。残る道は二つです。CHO細胞のような動物細胞へ進むか、糖鎖をヒト型に寄せた酵母株に投資するか。

ジスルフィド結合が多いタンパク質なら、酵母と糸状菌は小胞体の分泌経路で処理できます。大腸菌だけは、組む場所から設計しなければなりません。

2. 大腸菌の細胞質では、なぜジスルフィド結合が組めないのか

細胞質にはチオレドキシン還元酵素（trxB）とグルタチオン・グルタレドキシンの2つの還元経路が働いていて、システインのチオール基システイン残基が持つ-SH基。ジスルフィド結合の還元で生じ、マレイミドなどと結合する反応点になる。詳しく →を還元された側に保つからです。 一度できたジスルフィド結合も、そこでは安定に残りません。

だから設計は二通りに分かれます。

• ペリプラズムへ送る⁠：内膜と外膜のあいだの空間には、ジスルフィド結合を入れる酸化酵素と、間違ったつながりを組み替える異性化酵素（DsbCペリプラズムでジスルフィド結合の形成と組み直しを担う酵素群。DsbAが導入しDsbCが誤対合を直す。詳しく →）が備わっています（大腸菌のペリプラズム発現・分泌）。
• 細胞質細胞膜の内側のうち、核を除いた部分です。タンパク質の合成や多くの代謝反応がここで進みます。詳しく →を酸化的にした株を使う⁠：両方の還元経路（gor と trxB）を欠き、シグナル配列を外した DsbC を染色体に組み込んだ株では、細胞質でジスルフィド結合を持つタンパク質が折りたためます（Lobstein et al. 2012）。New England Biolabs の SHuffle がこの型です。

ここまで来てから、大腸菌の速さと安さを見ます。好条件での世代時間は20分前後で、合成培地細胞を体外で生存・増殖させるために必要な栄養・エネルギー源・成長因子などを含む液体または固体の環境基盤。詳しく →のフェドバッチなら乾燥菌体で100 g/Lを超える密度まで育ちます。

承認医薬品の実績も厚い宿主です。ラニビズマブ（眼科で使うFab重鎖の一部と軽鎖がジスルフィドで連結した約50kDaの抗体フラグメント。2本鎖で折りたたみがやや複雑。詳しく →）、セルトリズマブ ペゴル、カプラシズマブ（VHHラクダ科の重鎖抗体に由来し、単一ドメインで抗原を認識する小さなフラグメント。対合ミスが起きず安定。詳しく →）は、いずれも大腸菌で作られています（抗体フラグメントの微生物生産）。

発現を強めすぎると、折りたたみが追いつかず、不溶性の封入体として溜まります。可溶化してリフォールディングする二工程が増えるぶん、収率の見積もりが立てにくい。

手当ては一通りそろっています。発現温度を下げる、誘導を弱める、シャペロンタンパク質の折りたたみを助ける分子。共発現させると折りたたみ効率が上がり凝集が減ることがある。詳しく →を共発現する、ペリプラズムへ送る。培養上清まで分泌させる工業プラットフォーム（Wacker の ESETEC など）もあります。

3. 外膜のリポ多糖は、注射剤の工程設計をどう変えるのか

大腸菌はグラム陰性菌外膜をもつ細菌の分類。大腸菌が代表で、比較的壊しやすく外膜にエンドトキシンをもつ。詳しく →で、外膜にリポ多糖（LPS）を持っています。これがエンドトキシンです。菌体を壊して回収する工程なら、目的タンパク質と一緒に大量に出てきます。

⁠エンドトキシンの限度値は一律の表では決まらず、投与経路と1時間あたりの最大投与量から計算して置きます。1987年の指針にあった限度値の表は、投与量と製品の力価の種類が増えたために使わず、USP ⟨85⟩ の計算方法で求めます（FDA Pyrogen and Endotoxins Testing Q&A 第2版、問7）。髄腔内投与薬を脳脊髄液に直接投与する経路。血液脳関門を回避して中枢神経系へ核酸などを届ける。詳しく →、眼科用、医療機器は、この計算とは別に扱います（同、問7・問11）。

つまり、同じタンパク質でも投与経路と1回の投与量が変われば、除去工程に求める性能が変わります。宿主を大腸菌に決めた時点で、除去と測定を工程設計に入れておきます（エンドトキシンの管理と除去）。

4. 酵母は小胞体で折りたためるのに、糖鎖で何に引っかかるのか

酵母は単細胞でありながら、真核生物の分泌経路を持っています。小胞体で酸化的に折りたためるので、ジスルフィド結合の多いタンパク質を大腸菌より素直に扱えます。培養上清への分泌もでき、宿主タンパク質の少ない上清から精製を始められる利点は実務では大きい。

承認品の実績もあります。B型肝炎ワクチンの表面抗原は S. cerevisiae で作られてきました。Pichia では、2009年に米国で承認されたエカランチド（遺伝性血管性浮腫の急性発作の薬）があります。

引っかかるのは糖鎖です。酵母が付けるN型糖鎖は高マンノース型で、静脈内に投与すると抗原性が高くなりえ、肝臓で速く消えます⁠（Cereghino & Cregg 2000）。

• S. cerevisiae⁠：外鎖のマンノースが50〜150残基に伸びる過剰付加が起こります（同）。
• Pichia pastorisメタノールを炭素源にできる酵母。強力なAOX1誘導と分泌生産に向き、高密度培養で組換えタンパク質を作る。詳しく →⁠：分泌されるタンパク質の典型的な外鎖は Man8GlcNAc2 か Man9GlcNAc2 で、過剰付加は多くありません。末端のα-1,3結合のマンノースも見当たらないと報告されています（同）。
• α-1,3結合⁠：この結合があることが、酵母で作った組換えタンパク質遺伝子組換えで微生物や細胞に作らせた目的タンパク質。宿主により折りたたみやコスト、糖鎖が異なる。詳しく →の多くをヒト用の医薬品に使えなくしてきました（同）。

Pichia のほうが扱いやすいとはいえ、どちらもヒト型ではありません。免疫原性や糖鎖の均一性が規格に効く製品では、そこで候補から外れます。ヒト型に近づけた糖鎖工学細胞株や酵素で糖鎖の構造を制御し、ADCCなどの性質を作り込む技術。詳しく →株もありますが、株の入手と特性解析に相応の投資が要ります（酵母での組換えタンパク質生産、酵母の糖鎖ヒト化）。

5. 糸状菌の分泌力は、ヒトのタンパク質にも効くのか

自前のタンパク質なら桁違いに分泌しますが、ヒト由来のタンパク質では発現量が頭打ちになるので、菌株工学への投資を前提に選ぶ宿主です。

糸状菌は、分泌するために進化してきた生き物です。Aspergillus niger や Trichoderma reesei は自然界で大量の加水分解酵素を外に出しており、グルコアミラーゼやセルラーゼの工業生産が長年この系で回ってきました。

糸状菌 発酵培養用培地での発酵は5〜7日と長めです。それでも、出てくる量が違います。

ヒト由来のタンパク質になると、転写、翻訳、分泌のどこでも発現量が頭打ちになりえて、細胞外のプロテアーゼによる分解も加わります。糸状菌の100 g/L という分泌量が何の合計の値か、菌糸で粘る培養液をどう扱うかは、糸状菌のタンパク質生産の記事で説明しています。

対策は菌株工学です。強いプロモーターRNAポリメラーゼが結合して転写を開始するDNA上の特定の塩基配列領域。詳しく →を使い、内在の高分泌タンパク質と融合させてキャリアにし、プロテアーゼを欠損させた株を作る。糖鎖は付きますが、酵母と同じくヒト型ではありません。

6. 宿主を替えると、作り直しになるものは何か

宿主が変わると、測る不純物の顔ぶれが変わり、宿主由来不純物（HCP）の試験法は作り直しが必要です。 規格の置き方は ICH Q6B生物薬品の規格・試験方法の設定の考え方を示すICHガイドライン。力価などの規格を扱う。詳しく → にあり、HCP ELISA抗原と抗体の結合を酵素反応による発色などで検出し、目的の物質の有無や量を測る手法です。不純物や力価の測定に広く使われます。詳しく →（酵素結合免疫吸着測定法）に使う抗体は宿主ごとに別のものが要ります（酵母向けHCP ELISA、HCP ELISA）。見落としやすいのは、ここです。

宿主の下でも、選ぶ場面は続きます。同じ大腸菌でも株で性格が違い、発現に使う BL21 系統とクローニングに使う K-12 系統の JM109 を高グルコースのバッチ培養で比べた報告では、酢酸が BL21 では2 g/L以下にとどまり、JM109 では最大14 g/Lまで出ました（オーバーフロー代謝と酢酸生成）。

配列では、コドン最適化アミノ酸配列を変えずにDNAのコドンの並べ方だけを組み替え、発現量を高める設計操作。詳しく →が発現量を大きく動かします。ただし最頻コドンへ総入れ替えすれば良いとは限りません。翻訳を速くしすぎると、折りたたみが追いつかない場合があります（大腸菌のコドン最適化と発現）。

収量を上げる株への切り替えでは、不純物の顔ぶれが変わる危険もあります（微生物株の構築とセルバンク）。

宿主を絞る順番

• ステップ1：N型糖鎖⁠：薬効、半減期、免疫原性薬そのものが患者の免疫応答を誘発しやすい性質。凝集体や不純物、投与経路、患者背景などが要因になる。詳しく →に効くかを決めます。効くなら微生物系は外れるか、糖鎖工学株への投資を見込みます。
• ステップ2：ジスルフィド結合⁠：いくつあるかを数えます。複数なら、大腸菌はペリプラズムか還元経路を欠いた株、酵母・糸状菌は小胞体に任せます。
• ステップ3：出す先と下流⁠：培養上清か細胞内かを決めます。注射剤で大腸菌なら、投与経路から引いた限度値と除去工程を最初から見込みます。
• ステップ4：設備と期間⁠：施設がメタノールを扱えるか、発酵に5〜7日かけられるか、菌株工学に何か月使えるかを確かめます。
• ステップ5：試験法⁠：HCPを測る試験法が宿主ごとに作り直しになることを、分析法の開発計画に入れます。

受託先との最初の打ち合わせで問うのは、「どの宿主が多く作れるか」ではありません。「どの宿主なら、必要な修飾と純度のものを期限内に出せるか」です。宿主を決めたあとの工程は微生物発酵（大腸菌）の製造工程に、培養の槽は小型バイオリアクターにあります。

7. まとめ：宿主は、分泌量ではなく修飾と下流で決める

宿主は開発のいちばん早い時期に決める判断で、あとから替えると株構築も工程も分析法も出発点に戻ります。⁠押さえるのは3点です。

• 候補を切るのはジスルフィド結合とN型糖鎖の要否で、分泌量の表は最後に見る。
• 大腸菌を選ぶなら、ジスルフィド結合を組む場所（ペリプラズムか還元経路を欠いた細胞質）と、外膜のリポ多糖の除去を同時に設計する。
• 酵母と糸状菌の糖鎖は高マンノース型で、ヒト型が規格に効く製品では動物細胞か糖鎖工学株へ進む。

宿主を替える判断は、株の作り直しだけでは終わりません。宿主由来不純物（HCP）の試験法まで含めて見積もります。

参考文献

• Rosano GL, Ceccarelli EA. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol. 2014;5:172.（大腸菌の発現目的タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞内で転写・翻訳させ、機能的なタンパク質として産生させる工程。詳しく →系の利点と課題、封入体と可溶性の手当て）
• Lobstein J, Emrich CA, Jeans C, Faulkner M, Riggs P, Berkmen M. SHuffle, a novel Escherichia coli protein expression strain capable of correctly folding disulfide bonded proteins in its cytoplasm. Microb Cell Fact. 2012;11:56.（gor と trxB の還元経路を欠き、シグナル配列を外した DsbC を染色体に組み込んだ株で、細胞質でのジスルフィド結合の形成が可能になること）
• Cereghino JL, Cregg JM. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiol Rev. 2000;24(1):45-66.（S. cerevisiae の外鎖50〜150残基の過剰マンノース付加、P. pastoris の典型的外鎖 Man8-9GlcNAc2 と末端α-1,3結合マンノースの不在、高マンノース型糖鎖の抗原性と肝での速い消失、AOX1Pichiaでメタノール資化性を利用して強力に誘導するプロモーター。詳しく → の約5%の poly(A)+ RNA と30%超の可溶性タンパク質、GAP プロモーターの強さの比較）
• Nevalainen KMH, Te'o VSJ, Bergquist PL. Heterologous protein expression in filamentous fungi. Trends Biotechnol. 2005;23(9):468-474.
• FDA, Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing — Questions and Answers (Edition 2)（問7 1987年の指針の限度値の表は使わず USP米国で医薬品・原料・試験法の公式基準を定める公定書で、製薬用水に関する規格も収載されている。詳しく → ⟨85⟩ の計算方法で限度値を求めること、髄腔内・眼科用・医療機器の別扱い）
• Kalbitor（ecallantide）米国添付文書（Pichia pastoris の酵母細胞で組換えDNA技術により産生されるタンパク質であるという記載）
• ICH医薬品規制の国際調和を目的として、日米欧の規制当局と製薬業界が参加する国際的なガイドライン策定機関。詳しく → Q6B, Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products
• USP ⟨85⟩ Bacterial Endotoxins Test製品中のエンドトキシンを検出・定量するバクテリアエンドトキシン試験の総称。詳しく →（細菌内毒素試験。有償の規格のため本文は公開されていません）