酵母での組換えタンパク質生産：ピキアとサッカロミセスの使い分け

核心は一点です。酵母は大腸菌の扱いやすさと、真核生物の品質管理遺伝子治療製品の品質・安全性・有効性を保証するために製造・出荷の各段階で実施する試験・管理の総体。詳しく →機構を同時に持っています。その代わり、糖鎖はヒト型ではありません。大腸菌には無い仕組みが手に入るかわりに、CHO抗体など組換えタンパク質の生産に広く使われる、チャイニーズハムスター卵巣由来の培養細胞です。詳しく →で得られるものの一部は手に入らない。だから酵母は、真ん中の選択肢として位置づけられてきました。

この記事では、まず酵母がなぜ中間なのかを確かめ、Pichia pastorisメタノールを炭素源にできる酵母。強力なAOX1誘導と分泌生産に向き、高密度培養で組換えタンパク質を作る。詳しく → のメタノール微生物発酵でエネルギー源となる糖類などの炭素源と、目的遺伝子の発現を促す誘導物質のことです。詳しく →誘導と、その運用で出てくる壁、Saccharomyces cerevisiaeパン・ビール酵母として食経験が長い酵母。遺伝子操作ツールが豊富で、経口・食品関連の用途と親和する。詳しく → の持ち味、そして酵母共通の課題である糖鎖タンパク質に付加される糖の鎖状構造で、抗体の有効性・免疫原性などに影響する重要な品質特性。詳しく →の順に解説します。宿主全体の選び方は微生物の宿主・発現系の選び方にあります。最後に、二つの酵母を使い分ける順序を並べます。

酵母の立ち位置 ― 大腸菌とCHOのあいだ

酵母が中間だと言われるのは、二つの理由からです。

一つは真核生物の仕組みを持っていることで、小胞体で酸化的にフォールディングが進むぶん、ジスルフィド結合を複数持つタンパク質でも、大腸菌のように還元的環境で詰まることがありません。分泌経路もあるので、培養上清に出させる設計が取れます。

もう一つは、微生物としての扱いやすさです。培地は安く、培養は 3日 ほどで終わり、動物由来成分を使わずに組めます。CHOの培養が 14日 の桁であることを思えば、開発の回転速度がまるで違う。しかも Pichia はクラブツリー陰性で、糖を与えてもエタノールを溜めないため、高密度まで素直に伸びます。S. cerevisiae はここが逆で、糖の供給が一定を超えるとエタノールを作り始め、そこで密度が止まります。

真核の折りたたみと微生物の速さ。この二つを同時に取れるのが酵母の位置です。

Pichia ― AOX1 という強い誘導

Pichia pastoris の武器は AOX1 プロモーターRNAポリメラーゼが結合して転写を開始するDNA上の特定の塩基配列領域。詳しく →です。

これはメタノールを資化する経路の入口にある酵素の遺伝子で、メタノールを与えると猛烈に転写されます。誘導をかけると、アルコールオキシダーゼメタノール代謝の入り口を担う酵素。その遺伝子AOX1のプロモーターがPichiaの強力な誘導に利用される。詳しく →だけで全可溶性タンパク質の 30% に達することもある。この転写の強さをそのまま目的タンパク質に使えるのが、この宿主の中心的な価値です。

高密度培養にもよく耐えるので、グリセロールでバッチ培養し、フェドバッチ種培養で増やした細胞を大型の培養槽に移し、目的物質を本格的に産生させる最終段階の培養です。栄養を追加しながら育てるフェドバッチが広く使われます。詳しく →で菌体を増やしてから、メタノールに切り替えて誘導に入る。この流れで湿菌体 400〜500 g/L、乾燥菌体なら 100〜150 g/L まで持っていけます。分泌させれば培養上清の宿主タンパク質が少ないので、精製の入口も軽い。品目によっては上清で 10 g/L の桁に届きます。

構築はキット化が進んでいて、Thermo Fisher Scientific の発現キットが長く標準の位置にあります。分泌には α-factor出芽酵母のα接合因子に由来する、酵母の分泌発現で定番のプレプロ型リーダー。詳しく → のプレプロ配列を使うのが定番で、Kex2 が切断して成熟体を出します。配列そのものは ATUM のような会社にコドン最適化アミノ酸配列を変えずにDNAのコドンの並べ方だけを組み替え、発現量を高める設計操作。詳しく →と合成をまとめて出す流れです。

メタノールの代償 ― 発熱と可燃性

ただし、メタノールは製造現場では厄介な原料です。

引火点が 11℃ しかなく、空気中の爆発範囲は 6〜36% と広いので、常温でも可燃性の蒸気が出ます。これを数百リットルの発酵槽大腸菌や酵母などの微生物を高密度で培養する培養槽で、高い酸素供給や蒸気滅菌に対応した発酵用の設備です。詳しく →へ連続で供給するということは、防爆の設備と手順を用意するということです。既存の微生物棟がエタノールまでしか想定していないなら、そこで話が止まります。

酸素の要求も一段上がります。メタノールの酸化は酸素を大量に消費し、発熱も伴うので、溶存酸素培養液に溶けている酸素の濃度。細胞の呼吸を支えるため一定に保つ制御対象。詳しく →を 20〜30% に保つための供給と、槽の冷却能力が同時に問われます。誘導相は 70〜100時間 と長いため、この負荷が数日続きます。供給速度の制御は Sartorius や Eppendorf の発酵系が持つフィードフェドバッチで追い足す濃縮した栄養液。いつ・どれだけ・どう入れるかが生産性と品質を左右する。詳しく →制御で組みますが、オフガスのメタノール濃度まで見ないと、蓄積と枯渇のどちらにも振れます。

Saccharomyces ― 食経験と遺伝ツール

S. cerevisiae の持ち味は、積み上げの厚さにあります。

パン酵母として長い食経験があるので、規制上の扱いが軽くなります。遺伝子操作のツールも生物学の研究で徹底的に整備されてきたので、株を作り込む作業そのものが速く進みます。承認品の実績も古く、B型肝炎ワクチンの表面抗原やHPVワクチンのウイルス様粒子、インスリンの前駆体がこの酵母で作られてきました。

弱点は生産性の側に出ます。クラブツリー陽性なので、糖を多く与えるとエタノールを作ってしまい、密度が伸びません。フィードの設計で回避しますが、Pichia のような誘導の強さもないので、同じタンパク質なら到達する力価は低めに出ますし、分泌能も Pichia に劣ります。

Pichia は量と誘導、Saccharomyces は実績と作りやすさ。同じ酵母でも、効いてくる場面が違います。

糖鎖 ― ヒト型ではないという一点

酵母を選ぶときの本当の分かれ目は、ここにあります。

酵母は糖鎖を付けはしますが、ヒト型ではありません。S. cerevisiae では外鎖にマンノースが 50〜200 ほど連なる過剰マンノース化が起き、末端の α-1,3 結合のマンノースには免疫原性薬そのものが患者の免疫応答を誘発しやすい性質。凝集体や不純物、投与経路、患者背景などが要因になる。詳しく →の問題があります。P. pastoris は外鎖がここまで伸びず、Man8 から Man14 あたりの高マンノース型マンノースに富むN型糖鎖。フコースを欠くがクリアランスが速く、ADCC増強手段としては別扱いで監視する。詳しく →に留まりますが、それでもヒト型の複合型糖鎖ではありません。

糖鎖が薬効や半減期や免疫原性に効くタンパク質なら、この時点で酵母は候補から外れます。逆に、糖鎖が機能に関係しないか、そもそも付加部位を持たないタンパク質なら、酵母の欠点はほぼ消えます。ワクチン抗原やペプチド複数のアミノ酸がペプチド結合でつながった中分子化合物で、タンパク質より鎖が短いものを指す。詳しく →前駆体で酵母が長く使われてきたのは、この条件を満たしていたからです。

例外を作る道もあって、酵母の糖鎖経路を組み替えてヒト型に近づける糖鎖工学細胞株や酵素で糖鎖の構造を制御し、ADCCなどの性質を作り込む技術。詳しく →株がそれです。この系では、ヒト化 IgG を 90% 以上均一な糖鎖で作った報告があります（Li H, et al. 2006）。この系譜の株は Merck が GlycoFi の買収を通じて取り込みました。ただし株の入手と特性解析規格試験より高い分解能で製品の品質特性を詳しく調べること。比較可能性の評価などで用いる。詳しく →にかかる投資は小さくないので、選ぶなら最初から織り込む必要があります。

糖鎖が要るか要らないか。酵母を採れるかどうかは、ほぼこの一問で決まります。

二つの酵母を使い分ける順序

酵母で行くと決めた後、次の順で絞ると迷いが減ります。

一番目は、糖鎖の要否を確かめることです。 ヒト型が必要なら酵母ではなくCHOへ行くか、糖鎖工学株への投資を決め、要らないならそのまま次へ進みます。二番目に必要な量を見積もります。力価が要るなら Pichia、実績と作りやすさを優先するなら Saccharomyces、という分かれ方をします。

三番目に、設備がメタノールを扱えるかを確かめます。扱えないなら AOX1 は使えないので、GAP のような構成的プロモーター誘導剤なしに常時発現するプロモーター。酵母のGAPなどが代表。詳しく →か、Saccharomyces に寄せる判断です。四番目が分泌の要否で、上清に出せるなら精製の入口が軽くなるぶん、Pichia の分泌系が有利です。シグナル配列タンパク質をペリプラズムへ送るためN末端に付ける、宛先ラベルに相当する配列。詳しく →は α-factor から始めて、出なければ他を試します。

最後に培養の設計を詰めます。グリセロール相から誘導相への切り替え点、メタノールの供給速度、溶存酸素の目標、そして 70〜100時間 続く誘導相の冷却能力。⁠株を作り込む前に設備の制約を当てておくと、後で作り直さずに済みます。

参考文献

• Cereghino JL, Cregg JM. "Heterologous protein expression目的タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞内で転写・翻訳させ、機能的なタンパク質として産生させる工程。詳しく → in the methylotrophic yeast Pichia pastoris." FEMS Microbiology Reviews. 2000;24(1):45-66. PMID: 10640598. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10640598/
• "Komagataella phaffii (Pichia pastoris) as a Powerful Yeast Expression System for Biologics Production." Frontiers in Bioscience-Elite. 2024;16(2):019. DOI: 10.31083/j.fbe1602019. https://www.imrpress.com/journal/FBE/16/2/10.31083/j.fbe1602019
• Li H, et al. "Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris." Nature Biotechnology. 2006;24(2):210-215. PMID: 16429149. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16429149/
• FDA. "Guidance for Industry: Content and Format of Chemistry, Manufacturing and Controls Information and Establishment Description Information for a Vaccine or Related Product." https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents