大腸菌のペリプラズム発現・分泌：可溶性と正しい折りたたみを狙う

そこで有力な選択肢として浮上するのが、ペリプラズム（periplasm）——内膜と外膜のあいだの空間——への「ペリプラズム発現シグナル配列でタンパク質を大腸菌のペリプラズムへ送り、そこでジスルフィド結合を形成させる発現法。・分泌」です。N末端にシグナル配列（signal sequence＝タンパク質を特定の場所へ運ぶ「宛先ラベル」となる短いアミノ酸配列）を付けることで、タンパク質をここへ送り込めます。細胞質と違ってペリプラズム大腸菌の内膜と外膜の間の区画。細胞質より酸化的で、ジスルフィド結合が形成されやすい。は酸化的で、ジスルフィド結合の形成を助ける酵素群（Dsbファミリー）が備わっている。うまく設計できれば、封入体を避けつつ、正しく折りたたまれた可溶性タンパク質を狙えます。

とはいえ、押さえておきたい論点はいくつもあります。宛先ラベルの選び方、輸送に使う経路（SecとTat）、ペリプラズムでのジスルフィド形成のしくみ、浸透圧ショック高浸透圧から低浸透圧へ急に移して外膜を緩め、ペリプラズムの内容物を選択的に放出させる手法。などによる抽出、そして細胞質発現とどう使い分けるか——それぞれに設計判断が伴います。以下は製造・品質（CMC医薬品の化学・製造・品質管理に関する申請資料。原薬と製剤で章立てが分かれる。）の中立的な視点から見た勘所です。数値や難易度は目的タンパク質やプロセス条件に強く依存するため、あくまで一つの目安として読んでください。

なぜペリプラズムを狙うのか：可溶性と正しい折りたたみ

ペリプラズムを狙う一番の動機は、酸化的な環境でジスルフィド結合を形成させ、封入体を避けて正しく折りたたまれた可溶性タンパク質を得ることです。

細胞質は還元的（グルタチオンやチオレドキシン系がチオール基を還元側に保つ）に維持されており、ここでは分泌タンパク質や抗体フラグメント全長抗体から抗原認識に必要な部分だけを取り出した分子。Fcを持たず小さく、微生物でも作れる。のように複数のS-S結合を持つ分子は本来の結合を作りにくく、露出した疎水面どうしが会合して封入体になりがちです。これがペリプラズムへ目を向ける根本の理由です。一方ペリプラズムは酸化的で、後述するDsb系ペリプラズムでジスルフィド結合の形成と組み直しを担う酵素群。DsbAが導入しDsbCが誤対合を直す。がジスルフィド形成と組み直しを触媒します。分泌経路を通ることで、フォールディングが膜透過と共役して段階的に進む面もあり、細胞質での過剰な同時折りたたみに比べて凝集を避けやすい、と説明されます。

実務上の利点はもう一つあります。全菌体タンパク質に対してペリプラズム画分のタンパク質は限られるため、浸透圧溶液中の溶質濃度で決まる、水を引き込む圧。培養では上昇が細胞ストレスになる管理項目。ショックなどで選択的に取り出せば、精製の出発点での夾雑（きょうざつ）が細胞質破砕液より少なくなりやすい。ただし万能ではありません。輸送能力には上限があり、無理に高発現させると内膜前で詰まって前駆体が細胞質に溜まる、あるいはペリプラズム内で凝集する、といったことも起こります。得られる量は細胞質発現より控えめになりやすく、「量」と「質（可溶性・正しい折りたたみ）」のトレードオフをどこで取るかが設計の中心になります。

シグナル配列と輸送経路：Sec と Tat の違い

輸送経路にはSec折りたたむ前の紐状の状態でタンパク質を内膜に通す輸送経路。分泌タンパク質の多くが使う。とTat細胞質で折りたたみ終えたタンパク質をそのまま膜に通す輸送経路。輸送容量が小さい。の二系統があり、Secは折りたたむ前の状態で通し、Tatは細胞質で折りたたみ終えた状態で通すという根本的な違いがあります。

タンパク質をペリプラズムへ運ぶには、N末端（タンパク質の先頭側）にシグナル配列（シグナルペプチドとも呼びます）を付けます。この配列が輸送装置に認識され、膜を越えたあとにシグナルペプチダーゼシグナルペプチドの切断部位を認識し、輸送後に切り離す酵素。で切断されて成熟型が生まれます。代表的なシグナル配列タンパク質をペリプラズムへ送るためN末端に付ける、宛先ラベルに相当する配列。には、pelB、ompA、phoA、malE 由来のものなどがあります。どれが合うかは目的タンパク質次第で、複数を比較する（スクリーニングする）のが定石です。

Sec経路は、折りたたむ前の紐状（ひもじょう）の状態で内膜を通し、ペリプラズムに出てから折りたたませます。分泌タンパク質の多くはこの経路を使い、ジスルフィド形成をペリプラズム側に任せられます。一方Tat（twin-arginine translocation細胞質で折りたたみ終えたタンパク質をそのまま膜に通す輸送経路。輸送容量が小さい。）経路は、細胞質ですでに折りたたみ終えたタンパク質をそのまま通せる特殊な系で、細胞質でしか入らない補因子を必要とする場合などに使われます。ただし輸送容量が小さく大量生産には向きにくいとされる。⁠まずはSec型シグナル配列を複数試し、輸送効率と成熟型の割合で当たりを付けるのが実務的です。

ペリプラズムでのジスルフィド形成：Dsb 系のはたらき

ペリプラズムでは、DsbAペリプラズムでジスルフィド結合の形成と組み直しを担う酵素群。DsbAが導入しDsbCが誤対合を直す。がジスルフィド結合を導入し、DsbCペリプラズムでジスルフィド結合の形成と組み直しを担う酵素群。DsbAが導入しDsbCが誤対合を直す。が誤った結合を組み直す（異性化アスパラギン酸の形が変わる化学的分解。CDR内で起きると抗原への結合力が落ちうる。する）という分業でS-S結合の質が決まります。

酸化的なペリプラズムには、ジスルフィド結合の形成と品質管理を担うDsb（disulfide bond）ファミリーが存在します。DsbAが新しいS-S結合を素早く導入する「酸化」の担い手で、相棒のDsbBがDsbAを再酸化して働き続けられるようにします。ただしDsbAは近くのシステインを手当たり次第につなぐ傾向があり、システインを多く持つタンパク質では誤った組み合わせ（ミスペアリング由来の異なる重鎖・軽鎖が意図しない組み合わせで結合してしまう副産物発生の現象。）が生じることがあります。これを直すのがDsbC（と再還元役のDsbD）で、誤った結合を切って正しい配置へ組み直すイソメラーゼ分子内で原子の配置を組み替える異性化反応を触媒する酵素の総称。ここでは誤ったジスルフィドを正しく組み直す酵素（DsbC）を指す。（異性化酵素分子内で原子の配置を組み替える異性化反応を触媒する酵素の総称。ここでは誤ったジスルフィドを正しく組み直す酵素（DsbC）を指す。）として働きます。

システインを多数持つ、あるいは非連続的なS-S結合パターンを持つタンパク質では、DsbA/DsbBだけだと誤対合が残りやすい。そのため、⁠DsbCなどの異性化酵素を共発現させて正しい配置を促す手が有効なことがあります。加えて、フォールディングを助けるシャペロンタンパク質の折りたたみを助ける分子。共発現させると折りたたみ効率が上がり凝集が減ることがある。やペプチジルプロリルイソメラーゼ（Skp、FkpA など）の共発現、発現温度の低下、誘導の弱化（強すぎる発現を避ける）といった条件も、可溶性と正しい折りたたみに効きます。どの組み合わせが効くかはタンパク質ごとに異なるため、共発現因子と培養条件を格子状に振って探索するのが現実的です。

ペリプラズムからの抽出：浸透圧ショックほか

ペリプラズム画分は、外膜だけを選択的に緩める浸透圧ショックなどで、細胞質を壊さずに取り出せるのが利点です。

大腸菌は内膜・ペリプラズム・外膜という層構造を持つため、外膜だけを選択的に透過させれば、ペリプラズムの内容物を細胞質と分けて回収できます。代表的な手法が浸透圧ショック（osmotic shock）で、菌体をショ糖などの高浸透圧液に馴染ませてから、冷たい低張液へ一気に移して外膜側を緩め、ペリプラズムタンパク質を遊離させます。これにより、細胞質由来の夾雑タンパク質や核酸を大量に持ち込まずに、比較的きれいな出発材料を得やすくなります。

いずれの方法でも、選択性（ペリプラズムだけを狙って取れているか）と回収率はトレードオフの関係になりがちで、条件（浸透圧差、温度、時間、菌体密度）で結果が変わります。⁠スケールアップでは、遠心・濾過など後段の分離工程と合わせて、再現性のある条件を作り込むことが品質のばらつきを抑える鍵になります。抽出後の精製設計については微生物由来タンパクの精製も参考になります。

細胞質発現との比較：どちらを選ぶか

S-S結合を持つタンパク質や高い純度を早く得たい場合はペリプラズム、まず高い生産量を確保したい場合は細胞質（封入体経由を含む）が第一候補になりやすい、というのが大枠の整理です。

細胞質発現は、体積あたりの生産量を最大化しやすいのが強みです。封入体として蓄積すれば高濃度・高純度で回収でき、宿主プロテアーゼの影響も受けにくい。その反面、可溶化と封入体リフォールディングの解説に示すような再生工程が必要になり、収率とコストの不確実性を抱えます。ジスルフィド結合を持つタンパク質では、この折りたたみ直しがボトルネックになりやすい点が設計上の重荷になります。

一方ペリプラズム発現は、酸化的環境でのS-S形成と、抽出時点での夾雑の少なさが利点で、正しく折りたたまれた可溶性タンパク質をリフォールディング工程を挟まずに狙えます。ただし輸送容量の制約から量は控えめになりやすく、シグナル配列や共発現因子の作り込みという設計負荷が加わります。

どちらが正解かは、目的タンパク質の性質（S-S結合の数、疎水性、サイズ、補因子の要否）と、求める純度・量・コスト・納期の優先順位で決まります。宿主・発現系そのものの選び方は微生物の宿主・発現系の選び方で、大腸菌以外の選択肢も含めて整理しています。⁠単一の合格基準はないため、小スケールで両経路を並行評価し、可溶性・活性・純度・生産量を同じ物差しで比べて選ぶのが確実です。

まとめ

大腸菌のペリプラズム発現・分泌は、シグナル配列で内膜を越えさせ、酸化的なペリプラズムでジスルフィド結合を形成させることで、封入体を避けて正しく折りたたまれた可溶性タンパク質を狙う戦略です。輸送経路はSec（折りたたむ前に通す）とTat（折りたたみ後に通す）に大別され、多くの場合はSec型シグナル配列を複数比較するところから始めます。ペリプラズムではDsbAがS-S結合を導入し、DsbCが誤対合を組み直すため、システインの多いタンパク質では異性化酵素やシャペロンの共発現が助けになります。抽出は浸透圧ショックなどで選択的に行え、細胞質破砕より夾雑を抑えやすい利点があります。細胞質発現との使い分けは、S-S結合の有無・求める純度と量・納期の優先順位から逆算するのが実務的で、単一の合格基準はないため、小スケールでの並行評価が結局は近道になります。

参考文献

ガイドライン・基準

• ICH Q6B: Specifications — Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products（生物薬品の規格及び試験方法の設定）
• U.S. Pharmacopeia（USP）一般情報・タンパク質医薬品関連の一般試験法 https://www.usp.org/

主な文献

• Baneyx F, Mujacic M. Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nat Biotechnol. 2004;22(11):1399-1408. PMID: 15529165. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15529165/
• Rosano GL, Ceccarelli EA. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol. 2014;5:172. PMID: 24860555. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24860555/
• de Marco A. Strategies for successful recombinant expression of disulfide bond-dependent proteins in Escherichia coli. Microb Cell Fact. 2009;8:26. PMID: 19442264. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19442264/
• Kleiner-Grote GRM, Risse JM, Friehs K. Secretion of recombinant proteins from E. coli. Eng Life Sci. 2018;18(8):532-550. https://doi.org/10.1002/elsc.201700200