抗体フラグメント(Fab・scFv)の微生物生産：全長抗体との使い分け

カギはFcを持たず、グリコシル化タンパク質に糖の鎖を付ける翻訳後修飾。全長抗体のFc機能に重要だが、抗体フラグメントには不要。（糖鎖修飾＝タンパク質に糖の鎖を付ける翻訳後修飾）を必要としないという構造的な事実です。CHO細胞を使う大きな理由の一つは、Fc領域に付く糖鎖をヒトに近い形で再現することにあります。ところが抗原認識部分だけのフラグメント薬の起点となる分子量およそ300以下の非常に小さな有機分子。弱くても確かに結合するものを探す。には、そもそも糖鎖が要りません。だから糖鎖修飾タンパク質に糖の鎖を付ける翻訳後修飾。全長抗体のFc機能に重要だが、抗体フラグメントには不要。機構を持たない大腸菌でも、目的の機能を持ったタンパク質として成立するのです。

この記事では、Fab・scFv重鎖と軽鎖の可変ドメインを短いペプチドリンカーでつないだ1本鎖の抗体フラグメント。多価化しやすい。・VHHといった代表的なフラグメントの構造、大腸菌での発現・折りたたみ・精製の勘所、そして全長抗体（CHO抗体など組換えタンパク質の生産に広く使われる、チャイニーズハムスター卵巣由来の培養細胞です。詳しく →）との使い分けを取り上げます。判断の分かれ目は、糖鎖タンパク質に付加される糖の鎖状構造で、抗体の有効性・免疫原性などに影響する重要な品質特性。の要否とFcの有無という一点に集約されます。フラグメントの元になる抗体そのものの取得については抗体医薬の発見・スクリーニング手法を、全長抗体の製造全体像については抗体医薬の製造工程をあわせてご覧ください。

抗体フラグメントとは ― Fab・scFv・VHHの違い

抗体フラグメントは、全長抗体から抗原認識に必要な部分だけを取り出した分子です。Fcを持たないぶん小さく、それが生産のしやすさにも直結します。

全長のIgG抗体は、抗原を掴む「腕」の部分（Fab領域）と、免疫細胞や補体と相互作用したり血中滞留を担ったりする「土台」の部分（Fc領域抗体の定常部にあたる「足」の部分。FcγRや補体、FcRnと相互作用し、機能や血中半減期を担う。）に大別されます。抗体フラグメントは、このうち抗原認識に関わる部分を切り出した分子群の総称です。代表的なものを整理すると次のようになります。

「kDa（キロダルトン）」はタンパク質の大きさ（分子量）の単位です。全長IgGが約150 kDaであるのに対し、フラグメントはその1/3から1/10ほど。この小ささが組織浸透性の高さや生産の容易さという利点を生む一方、後述する半減期薬の血中濃度が半分に下がるまでの時間。抗体フラグメントでは短く、延長の工夫が要る。の短さという宿題もセットでついてきます。

VHH（single-domain antibody、いわゆるナノボディラクダ科の重鎖抗体に由来し、単一ドメインで抗原を認識する小さなフラグメント。対合ミスが起きず安定。）は、ラクダやアルパカなどラクダ科動物が持つ「重鎖だけの抗体」に由来する特殊なフラグメントです。FabやscFvがVHとVLという2つのドメインの組み合わせで抗原を認識するのに対し、VHHラクダ科の重鎖抗体に由来し、単一ドメインで抗原を認識する小さなフラグメント。対合ミスが起きず安定。は単一ドメインで完結します。鎖どうしの対合ミスが原理的に起きないため、遺伝子工学的な改変（多価化や融合）の設計が相対的に素直です。

なぜ微生物で作れるのか ― Fc・糖鎖・ジスルフィド

抗体フラグメントが大腸菌で作れる本質的な理由は二つ。Fc由来の糖鎖修飾が不要であること、そして必要なジスルフィド結合が適切な区画を選べば形成できること、です。

全長抗体をCHO細胞のような哺乳類細胞で作る主な理由は二つあります。一つはFc領域に付くN型糖鎖を、ADCC（抗体依存性細胞傷害抗体FcがNK細胞などのFcγRIIIaに結合し、そのエフェクター細胞に標的細胞を傷害させる作用。）や補体活性化T細胞を抗原刺激や人工的な刺激試薬で活性化し、増殖・機能発揮できる状態に誘導する操作。、血中安定性に適した形で付けること。もう一つは、複雑な多量体タンパク質を正しく折りたたみ、分泌させる仕組みが備わっていることです。抗体フラグメントは、このうち前者の「糖鎖」を必要としません。Fcがないか使わない分子なので、糖鎖修飾機構を持たない大腸菌でも機能上の問題が生じないのです。

残る課題はジスルフィド結合（システイン残基どうしがつくるS-S結合＝タンパク質の立体構造を留める橋）の形成です。抗体フラグメントはこの結合を正しく作らないと機能しません。ところが大腸菌の細胞質（サイトプラズム）は還元的な環境で、S-S結合が形成されにくい。この問題への標準的な答えが、次章のペリプラズム発現シグナル配列でタンパク質を大腸菌のペリプラズムへ送り、そこでジスルフィド結合を形成させる発現法。です。加えて近年は、細胞質内でもS-S結合システイン残基どうしが作るS-S結合。タンパク質の立体構造を留める橋になる。形成を助ける酵素を共発現させる工夫（例：CyDiscoのような系）で細胞質細胞内部の区画。大腸菌では還元的で、そのままではジスルフィド結合ができにくい。発現を成立させるアプローチも、研究・実用化が進んでいます。

大腸菌ペリプラズム発現の勘所

折りたたみを成立させる王道は、シグナル配列でフラグメントをペリプラズム大腸菌の内膜と外膜の間の区画。細胞質より酸化的で、ジスルフィド結合が形成されやすい。へ運び、そこでジスルフィド結合を形成させることです。

大腸菌のペリプラズムは、内膜と外膜の間にある区画で、細胞質より酸化的な環境です。ここにはDsbA/DsbBといったジスルフィド結合を作る酵素系や、間違った結合を組み替えるDsbCなどが備わっており、抗体フラグメントの折りたたみに適しています。実務では、タンパク質のN末端にシグナル配列タンパク質をペリプラズムへ送るためN末端に付ける、宛先ラベルに相当する配列。（PelBタンパク質をペリプラズムへ送るためN末端に付ける、宛先ラベルに相当する配列。やOmpAタンパク質をペリプラズムへ送るためN末端に付ける、宛先ラベルに相当する配列。など、ペリプラズムへの「宛先ラベル」に相当）を付けて発現させ、翻訳と同時にペリプラズムへ送り込むのが定石です。このペリプラズム発現の設計については大腸菌のペリプラズム発現・分泌で個別に掘り下げています。

ただし、ペリプラズム発現は利点ばかりではありません。実際の生産で収量や品質のボトルネックになりやすい点を、以下に整理します。

• 移行効率と容量⁠：ペリプラズムは容積が小さく、膜を越える移行（トランスロケーション）が律速になりやすい。強すぎる発現はかえって詰まりを生みます。
• 封入体大腸菌内で不溶性の塊（封入体）になったタンパク質を可溶化し、正しい立体構造へ巻き戻して活性を回復させる操作です。詳しく →（インクルージョンボディ）：折りたたみが追いつかないと、不溶性の凝集体タンパク質分子どうしが結合してできた高分子量の集合体です。有効性や免疫原性に影響するため、その含量を測ります。詳しく →として溜まります。可溶性の活性型として得るには、発現量とのバランス調整が要ります。
• リーク（漏出）：ペリプラズムのタンパク質が培地側へ漏れ出ることがあり、回収戦略に影響します。溶存酸素や培地組成、宿主株の選択でも挙動が変わります。
• シャペロンの共発現⁠：DsbCやPDI（タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ）などを補うと、折りたたみ効率が上がり凝集が減ることがあります。

FabはS-S結合が多く（分子内に複数〜数本）、scFvは2本と、フラグメントごとに折りたたみの難しさが異なります。単一鎖で対合を気にしなくてよいscFvやVHHのほうが比較的素直に作りやすく、Fabは条件検討に手間がかかる傾向がある——これが実務的な出発点になるでしょう。いずれにせよ、宿主株・シグナル配列・発現誘導条件・培養条件を組み合わせて最適化していく世界であり、単一の正解レシピは存在しません。

精製 ― Protein Aが使えないという前提

フラグメント精製の要点は、全長抗体の「Protein Aプラットフォーム」がそのままでは使えず、分子ごとに捕捉戦略を組む必要があることです。

全長抗体の下流工程が比較的定型化しているのは、Fc領域に結合するProtein Aアフィニティークロマトグラフィーという強力な共通ツールがあるからです。ところが抗体フラグメントはFcを持たない（またはFab側のみ）ため、Protein Aがそのままでは使えません。ここが、フラグメント精製が全長抗体と大きく異なる点です。代替として、次のような捕捉手段が状況に応じて使われます。

商用の原薬では、タグに頼らず分子固有の性質（電荷・疎水性・サイズ）を組み合わせて設計するのが一般的です。分子ごとに精製プロセスを作り込む前提になる点は、全長抗体との大きな違いといえます。「Protein Aで捕まえて仕上げる」定型フローとフラグメントでの違いを対比して理解すると見通しが立ちやすいでしょう（全長側の流れは抗体医薬の製造工程を、微生物由来タンパクの精製一般は微生物由来タンパクの精製を参照）。

大腸菌由来という点では、宿主由来タンパク質（HCP）に加えて、内毒素（エンドトキシン＝グラム陰性菌の外膜成分。発熱性物質）の除去・管理が品質上の重要な論点になります。哺乳類細胞ではウイルスクリアランスが主題になるのと対照的に、微生物ではエンドトキシン管理がダウンストリームの設計に直接効いてきます。

全長抗体（CHO）との使い分けと半減期の宿題

フラグメントは「小さく作りやすい」利点と引き換えに半減期の短さを抱えています。用途に応じて全長抗体と使い分けるのが、実務の落とし所です。

抗体フラグメントの最大の弱点は、血中半減期の短さです。全長IgGは、Fc領域がFcRn（新生児型Fc受容体）というリサイクル機構に結合することで、数週間という長い半減期を保っています。フラグメントはこのFcを持たないうえ、分子が小さいと腎臓から速やかにろ過されてしまうため、そのままでは血中滞留時間が非常に短くなります。この課題への対処として、次のような設計がよく採られます。

• PEG化（ペグ化）：ポリエチレングリコールを結合させて見かけの分子サイズを大きくし、半減期を延ばす。
• アルブミン結合⁠：血中アルブミンに結合するモジュールを融合し、アルブミンの長い半減期に相乗りする。
• Fc融合・多価化⁠：目的に応じてFcや別ドメインと融合し、滞留やアビディティ（多価結合による見かけの親和性）を調整する。

一方で、半減期の短さがむしろ利点になる場面もあります。局所投与（眼内など）で作用させたい場合、造影・診断で速く体外へ抜けてほしい場合——そういった用途では、小さく速く消えるフラグメントが向きます。実際に承認・上市された例を挙げると、次のように用途と設計の対応が見えてきます。

使い分けの軸は三つに集約されます。「Fcの機能（ADCCや長い半減期）が欲しいかどうか」「組織浸透や速い体内動態が欲しいかどうか」「糖鎖が要るかどうか」。Fcの機能をフルに使いたい主力の治療用mAbは今もCHOでの全長抗体が中心で、フラグメントはその特性が活きる用途で選ばれます。補完関係として捉えると、両者の位置づけが整理しやすいでしょう。

まとめ

抗体フラグメント（Fab・scFv・VHH）は、Fc由来の糖鎖修飾を必要としないという構造上の理由から、大腸菌などの微生物で製造できる抗体医薬です。折りたたみに必要なジスルフィド結合は、酸化的なペリプラズムへ送り込むか、細胞質にS-S形成を助ける酵素を補うことで成立させられます。

一方で、フラグメント特有の宿題もあります。Protein Aによる定型精製が使えず分子ごとに捕捉戦略を組む必要があること、エンドトキシン管理がダウンストリームの主題になること、半減期が短くPEG化やアルブミン結合などで補う必要があること——この三点です。Fcの機能や長い半減期を活かしたい主力mAbはCHOでの全長抗体が中心で、組織浸透や速い体内動態、局所投与が活きる用途ではフラグメントが選ばれます。両者を補完関係として捉えると、使い分けの判断軸が見通しやすくなります。

参考文献

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