微生物発酵のスケールアップ：酸素供給とせん断の壁

だから設計の軸は、溶かし込む速さをどう確保し続けるかに移ります。しかも稼ぐ手立てが、そのまま別の壁を生む。撹拌を強めれば酸素は入りますが、発熱も混合の不均一も泡立ちも増えます。一つ動かすたびに、別の何かが動く構造です。本稿では、酸素が律速に回る理由から始めます。そのうえで、OURとkLaの桁、kLaを稼ぐ手立てとその代償、撹拌の副作用、大腸菌の酢酸蓄積、そして哺乳類培養との設計思想の違いを整理します。最後に、スケールアップ小型培養で確立した条件を、より大きなバイオリアクターへ拡大する取り組みです。酸素供給の指標kLaなどを揃え、性能を再現します。詳しく →を決める順番を並べます。数値は株と培地細胞を体外で生存・増殖させるために必要な栄養・エネルギー源・成長因子などを含む液体または固体の環境基盤。詳しく →と装置によって動くので、自社の系での実測を前提に、桁の感覚として読んでください。桁が違うという一点さえ押さえておけば、哺乳類培養の経験を誤って持ち込むことは避けられます。

酸素が律速になる理由 ― 在庫が数十秒分しかない

溶存酸素培養液に溶けている酸素の濃度。細胞の呼吸を支えるため一定に保つ制御対象。詳しく →の在庫は、驚くほど少量です。

飽和でも 7 mg/L 前後。培養液 1 L の中に、酸素はミリグラムの桁でしか存在しません。糖なら g/L の桁で入れておけるのに、酸素だけは貯めておけません。高密度で回っている大腸菌や酵母は、これを数十秒で消費します。つまり供給が止まれば、分を待たずに酸素不足へ落ちます。

酸素移動速度培養液へ酸素が移動する速さ。kLaと溶存酸素の濃度差の積で表される。詳しく →は、酸素移動容量係数 kLa と、飽和溶存酸素から実測値を引いた濃度差の積で決まります。培養が成り立つには、この供給が消費を上回り続けていなければなりません。

在庫で凌ぐ余地がないので、流量で勝負するしかない。 微生物発酵大腸菌などの微生物を培養槽で増やし、目的タンパク質などを作らせて回収する製造工程です。詳しく →のスケールアップは、増えていくOUR細胞が単位時間あたりに消費する酸素の速度。酸素要求速度。詳しく →に対して、いかにkLaを確保し続けるかという設計問題です。

OURとkLaの桁 ― 哺乳類との差

桁を並べると、なぜ設計思想が変わるのかが見えます。

大腸菌の倍加時間は 20〜30分 で、CHO細胞抗体など組換えタンパク質の生産に広く使われる、チャイニーズハムスター卵巣由来の培養細胞です。詳しく →は 20〜30時間 です。代謝の速さが桁で違うので、酸素要求も桁で違います。高密度の微生物発酵で求められる kLa は数百 h⁻¹ の領域に入り、哺乳類細胞培養では 5〜20 h⁻¹ あたりで足ります。

投入する撹拌動力も同じです。微生物発酵では体積あたり 2,000〜5,000 W/m³ を入れることが珍しくありません。哺乳類細胞培養では 20〜100 W/m³ の桁で、二桁違います。

通気も違います。微生物では培養液1 L あたり毎分 1 L 近い空気を送ることがありますが、哺乳類ではその100分の1の桁です。

そして高密度培養菌体を高い密度まで増やして、容積あたりの生産性を高める培養。詳しく →では、乾燥菌体重量が 100 g/L を超えることもあります。この菌体量が一斉に呼吸します。 同じ「培養のスケールアップ」という言葉でも、扱っている量が二桁違うので、経験はそのまま転用できません。

kLaを稼ぐ四つの手と、その代償

手立ては四つあります。どれも代償を伴います。

撹拌を強める。体積あたりの投入動力を上げると、気泡が細かく分散して界面積が増え、kLa が上がります。かわりにせん断応力撹拌や通気で細胞にかかる引きちぎる力。強すぎると細胞が傷つくため制御が要る。詳しく →と発熱と動力コストが増えます。

通気量を増やす。供給される酸素そのものが増えます。かわりに泡立ちが増え、CO₂ が抜けすぎ、限度を超えればフラッディング通気量が過大で撹拌翼が気泡に覆われ、分散能力が低下する状態。を起こして逆に混ざらなくなります。

純酸素で富化する。濃度差、つまり推進力が増えます。かわりにガスコストと安全管理が乗り、DO制御も一段複雑です。

槽内圧を上げる。溶解度そのものが上がります。かわりに設備の耐圧が要り、CO₂ も一緒に溶け込みます。

実務では段階的に組みます。まず撹拌を上げ、次に通気を増やし、最後に純酸素を混ぜる。このDOカスケード撹拌・酸素分圧・純酸素スパージングと制御量を段階的に切り替え、溶存酸素を維持する方式。で、過度なせん断流れの中で分子にかかる物理的な力。強すぎると抗体の凝集や微粒子発生を招く。詳しく →とガスコストを避けながらDOを保ちます。

インペラも違います。微生物発酵では、哺乳類培養で好まれる低せん断のマリン型ではなく、気泡を強く分散させるラシュトンタービン気泡を強く分散させる高せん断型の撹拌翼。微生物発酵で主流。のような高せん断型が主流です。細菌の細胞壁は丈夫で多少のせん断には耐えるので、酸素供給を優先した設計が成り立ちます。槽の側は Getinge の Applikon BioPilot、Sartorius の Biostat、Eppendorf の BioFlo、INFORS HT、Bionet、Solaris Biotech といったラインアップがあり、大型ならZETAやABEC、Pierre Guerin が並びます。

撹拌が生む副作用 ― 発熱、混合時間、泡

酸素を稼ぐために撹拌と通気を強めると、裏で三つの課題が持ち上がります。

発熱です。微生物は活発に代謝するぶん多くの代謝熱を出します。加えて、撹拌に投入した機械的な動力も最終的には熱に変わります。容積が増えるほど、体積あたりの放熱に使える表面積の割合は下がるので、大スケールでは熱が逃げません。高密度培養では、冷却能力そのものが制約になることがあります。ジャケットや内部コイルが追いつかなければ、温度が設定から外れます。

混合時間添加した成分が槽内で均一になるまでの時間。大スケールほど延び、濃度勾配を生む。詳しく →です。添加した成分が槽内で均一になるまでの時間で、小スケールなら数秒ですが、大型槽では 1分 を超えることもあります。微生物は基質の取り込みも代謝回転も速いので、混合が遅れると、フィードフェドバッチで追い足す濃縮した栄養液。いつ・どれだけ・どう入れるかが生産性と品質を左右する。詳しく →添加点の近くだけ基質が濃い、塩基添加点の近くだけ局所的にpHが高い、といった勾配ができます。細胞はこの濃淡の中を循環します。

泡です。高い通気量と強い撹拌、培地中のタンパク質が重なると泡が立ちます。泡はプローブへの干渉、汚染リスク、有効培養体積の減少を招く。消泡剤は効きますが、過剰になると気泡を合一させてkLaを下げます。Struktol の J 673 A、Dow の XIAMETER、Merck の Antifoam培養や撹拌で生じる泡を抑えるために加える添加剤で、泡による酸素供給の低下やあふれを防ぎます。詳しく →、信越化学工業の KM-72GS といった製品を、量とタイミングを見ながら使います。 泡を抑えようとして酸素が入らなくなる。この逆転を避けるのが、地味ですが効く判断です。

大腸菌の酢酸蓄積

大腸菌の高密度培養で繰り返し問題になるのが、酢酸の蓄積です。

大腸菌は、グルコースが過剰にある、あるいは酸素が足りないといった条件で、糖を完全に酸化しきれず酢酸を排出する代謝へ切り替わります。オーバーフロー代謝グルコースが潤沢なとき解糖が過剰になり、余った分を乳酸として排出する余剰代謝。詳しく →と呼ばれる現象で、処理しきれない炭素をいったん酢酸として吐き出す、と理解されています。

出てきた酢酸は二重に効きます。炭素源の無駄であると同時に、菌体の増殖を妨げ、目的タンパク質の生産性を下げます。報告では、5 g/L 前後 から増殖の阻害が顕著になり、組換えタンパク質遺伝子組換えで微生物や細胞に作らせた目的タンパク質。宿主により折りたたみやコスト、糖鎖が異なる。詳しく →の生産性はもっと低い濃度から落ち始めるとされます。

引き金は四つです。グルコース微生物発酵でエネルギー源となる糖類などの炭素源と、目的遺伝子の発現を促す誘導物質のことです。詳しく →の過剰供給。酸素供給の不足。大スケールでの基質勾配。そして高い比増殖速度細胞集団が増える速さの指標。高浸透圧で大きく低下し、比生産性とトレードオフになる。詳しく →。

対策の基本は、作らせない運転です。フィードを絞ってグルコースを低く保つフェドバッチ種培養で増やした細胞を大型の培養槽に移し、目的物質を本格的に産生させる最終段階の培養です。栄養を追加しながら育てるフェドバッチが広く使われます。詳しく →が代表的な手立てで、菌が処理できる速さに合わせて糖を供給すればオーバーフローに傾きにくくなります。同時にDOを切らさないことも欠かせません。 酸素が足りなければ、糖を絞っても酢酸は出ます。ここで酸素供給の話と酢酸の話がつながります。

大スケールで酢酸が出る理由

小スケールでは見えなかった酢酸蓄積が、大スケールで顔を出す。その理由は前節の混合時間にあります。

小スケールでは混合が速いので、フィードした糖は瞬時に薄まります。局所的な過剰が起きません。ところが大スケールでは混合時間が延び、フィード添加点の近くだけ糖が濃い領域ができます。

菌はその領域を通過するたびに、一時的にオーバーフロー代謝へ振れます。槽の中を循環するので、通過は何度も起きる。平均の糖濃度はきちんと低く保たれているのに、酢酸が溜まっていく。

だからスケールダウンモデル大スケールで起こる勾配やストレスを小さな槽で再現し、事前にリスクを評価する実験系。詳しく →では、平均濃度を合わせるだけでは足りません。基質勾配そのものを再現する、つまり細胞が高濃度域と低濃度域を往復する状況を作らないと、大スケールで起きることが予測できません。 酢酸の蓄積は、糖の供給設計と酸素供給と混合時間が重なって生じる、スケールアップに固有の課題です。

哺乳類培養と設計思想が逆

同じ培養のスケールアップでも、微生物と哺乳類では律速も勘どころも違います。どちらかの経験を持つ人がもう一方へ踏み込むとき、ここを取り違えると見落としが出ます。

微生物では、細胞が丈夫なので強い撹拌が許され、その結果として高い kLa を狙えます。律速は酸素供給と発熱除去の側に来ます。副産物は大腸菌の酢酸。培養期間は数時間から数日です。

哺乳類では、細胞膜がむき出しで物理的なストレスに弱く、強い撹拌や気泡の破裂で傷つきます。撹拌はほどほどに抑えるので酸素供給を上げにくく、そのぶん CO₂ の蓄積や栄養と品質の勾配、せん断が律速に回ります。副産物は乳酸とアンモニアグルタミンの代謝と化学分解で生じる代謝副産物。蓄積すると増殖・生存を落とし、糖鎖の質にも影響する。詳しく →。培養期間は1週間から2週間を超えます。詳しくはバイオリアクターのスケールアップの側で扱っています。

そこで重視される翼端速度撹拌翼の先端の周速。翼まわりの最大せん断の目安で、細胞損傷を避ける上限管理に使う。詳しく →の管理やせん断の抑制は、微生物発酵ではむしろ優先度が下がる。 微生物では酸素供給を、哺乳類ではせん断と勾配を、第一の制約として設計します。この取り違えが、経験の転用をいちばん誤らせます。

スケールアップを決める順番

最後に、順番を並べます。

先に出すのは目標のOURです。到達したい菌体量と比酸素消費速度から、その槽が何を供給しなければならないかが決まります。ここから必要な kLa が h⁻¹ で出ます。 必要なkLaが出る前に槽の大きさを決めると、酸素が入らない槽ができます。

次に、その kLa を四つの手立てにどう割り振るかを決めます。撹拌でどこまで稼ぎ、通気でどこまで、純酸素と加圧をどこから使うか。この配分で、発熱の量と泡の立ち方が決まります。

そのうえで冷却能力を確かめます。代謝熱と撹拌動力の合計に、ジャケットと内部コイルが追いつくか。追いつかなければ、撹拌を上げる余地がそこで切れます。

最後に、基質勾配を前提にフィードを設計します。平均の糖濃度ではなく、添加点近傍で何が起きるかを見る。 大スケールで酢酸が出るかどうかは、フィードの総量ではなく、どこから入れて何秒で混ざるかで決まります。

参考文献

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• Eiteman MA, Altman E. Overcoming acetate in Escherichia coli recombinant protein fermentations. Trends in Biotechnology. 2006;24(11):530-536.
• ICH Q11原薬の開発・製造を扱い、原薬側の管理戦略の作り込みを示すICHのガイドライン。詳しく →, Development and Manufacture of Drug Substances
• ICH Q8医薬品開発とQbDの考え方を示すICHガイドライン。重要品質特性（CQA）を定義している。詳しく →(R2), Pharmaceutical Development