CYP reaction phenotypingとは？ 寄与率fmの算出と3つのアプローチ

この数字が重視されるのは、fmが薬物間相互作用(DDI＝Drug-Drug Interaction併用薬が代謝酵素を阻害・誘導し合い、血中濃度が変動する現象。fmはこのリスク評価の土台になる。)のリスクを見積もる土台になるからです。ある化合物のfmがCYP3Aで大きければ、CYP3Aを強く阻害・誘導する併用薬によって血中濃度が大きく動きうる。逆にfmが複数の分子種に分散していれば、一つの阻害剤トランスポーターの働きをふさぐ薬。他の基質薬の輸送を妨げ、短期間で濃度を変える。の影響は薄まります。

fmの算出には主に三つのアプローチがあります。選択的化学阻害剤法分子種を狙って効く阻害剤を加え、代謝がどれだけ抑えられるかからfmを推定する方法。、組換えCYP(rCYP)にISEF（分子種間活性差係数組換え系とヒト肝の酵素活性差を補正する分子種間活性差係数。基質依存でばらつく点に注意する。）を掛ける方法、そして相対存在量に基づく方法。それぞれ長所と落とし穴が異なり、規制当局は複数のアプローチを組み合わせて整合を確認することを求めています。数字一つに見えるfmの背後には、こうした求め方の違いと、DDI併用薬が代謝酵素を阻害・誘導し合い、血中濃度が変動する現象。fmはこのリスク評価の土台になる。評価への直結という重みがあります。

寄与率fmとは何か

fmはヒト肝での総代謝クリアランス薬が血中から取り除かれる速さ。ADCでは薬物が多く付いた高DAR種ほど速まりやすい。に対する、ある分子種の寄与の割合です。すべての分子種のfmを足すと1（100%）になるように定義します。たとえばCYP3Aのfmがおおむねゼロコンマ7、CYP2D6が0.2、残りが他の分子種——というかたちで代謝の内訳を表します。

ただし、この割合は代謝そのものが化合物の消失にどれだけ効くか（消失全体に占める肝代謝の割合）とは別の話です。腎排泄が主体の化合物なら、CYP肝臓に多く存在する代表的な薬物代謝酵素群。多くの低分子医薬の代謝を担う。のfmが高くても全身クリアランスへの影響は限られます。fmはあくまで「代謝の中の内訳」。DDIの大きさを見るときは、代謝が消失に占める割合とあわせて読む必要があります。

reaction phenotypingでは、まずCYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A（CYP3A4腸と肝に多く存在し多くの薬を代謝する酵素。その基質は初回通過で削られやすい。/3A5）といった主要分子種を対象に据えるのが一般的です。 fmは分子種と基質ごとに固有の値であり、単一の絶対値ではなく複数手法の整合として確からしさを担保するものです。

アプローチ1：選択的化学阻害剤法

ヒト肝ミクロソーム肝細胞から調製した代謝酵素を含む画分。複数分子種が同時に働く実態のまま代謝を測れる。(HLM肝細胞から調製した代謝酵素を含む画分。複数分子種が同時に働く実態のまま代謝を測れる。)や肝細胞に、分子種を狙って効く阻害剤を加え、代謝がどれだけ抑えられるかからfmを推定する方法です。CYP2D6にはキニジン、CYP3Aにはケトコナゾールやアザムリンといった選択的阻害剤が使われます。阻害剤の存在下で代謝が落ちた割合が、その分子種のfmの目安になります。

この方法の利点は、HLMという生理に近い系で、複数分子種が同時に働く実態のまま測れる点です。問題は阻害剤の選択性目的物と不純物を、溶出位置をどれだけ離して分けられるかの度合い。分離の分解能を左右する。にあります。ケトコナゾールはCYP3Aを強く阻害しますが、濃度を上げると他の分子種にも効いてしまうことが知られており、単一濃度では選択性が濃度依存で崩れます。狙った分子種だけを止めきれず他の経路まで巻き込むと、fmが過大評価されます。

対策として、単一濃度ではなく阻害曲線阻害剤の濃度を振って完全阻害まで見る曲線。非選択的な効きを差し引く工夫に使う。（濃度を振って完全阻害まで見る）を取り、非選択的な効きを差し引く工夫が使われます。 化学阻害剤法は生理に近い系で測れる強みがある一方、阻害剤の選択性が濃度依存で崩れる点に注意が要ります。

アプローチ2：組換えCYP(rCYP)＋ISEF

もう一つは、分子種を一種類ずつ発現させた組換えCYP(rCYP)を使う方法です。各rCYPで化合物の固有クリアランス酵素そのものの代謝能力を表すクリアランス。組換えCYPで分子種ごとに測り、換算の元にする。を個別に測ることで、どの分子種が代謝しうるかを切り分けられます。ただし、rCYP分子種を一種類ずつ発現させた酵素。個別に固有クリアランスを測れるがヒト肝とは環境が違う。の発現量細胞が目的のタンパク質を作る量。低いと必要量の確保に手間がかかり、製造コストが上がる。や補酵素タンパクの環境はヒト肝と異なるため、そのままの数字を足してもヒト肝の内訳にはなりません。

そこを橋渡しするのがISEF（Inter-System Extrapolation Factor組換え系とヒト肝の酵素活性差を補正する分子種間活性差係数。基質依存でばらつく点に注意する。＝分子種間活性差係数）です。ISEFは、組換え系とヒト肝の間で、酵素の内在活性や補助タンパクの発現差をまとめて補正する係数。プローブ基質（分子種ごとの代表的な指標反応）を使ってあらかじめ分子種ごとにISEFを求めておき、rCYPで測った固有クリアランスにISEFと肝ミクロソーム肝細胞をすりつぶして得た小胞体由来の画分。CYPなどの代謝酵素が濃縮され、代謝安定性の評価に使う。中の各分子種の存在量を掛け合わせてヒト肝でのクリアランスに換算し、その内訳からfmを出します。

概念としては、次のような掛け合わせでヒト肝クリアランス肝臓が血液から薬物を除去する能力。固有クリアランス・肝血流量・タンパク結合から予測する。を組み立てます。

注意したいのは、ISEFが基質によってばらつくと報告されている点です。CYP3A4では、指標に使うプローブ基質分子種ごとの代表的な指標反応を測るための基質。ISEFやRAFを求めるのに使う。によってISEFが数倍規模で変動したという報告があり、一つの係数を使い回すと寄与率がずれます。 rCYP＋ISEFは分子種ごとに切り分けられる強みがある一方、ISEFの基質依存性が結果を左右するため、単独では確定させにくい方法です。

アプローチ3：相対存在量と整合の取り方

三つ目は、各分子種の肝ミクロソーム中の存在量（相対存在量）を重みとして使う考え方です。rCYPで得た活性に、実際の肝にどれだけその分子種が存在するかを掛けて内訳を作ります。RAF（Relative Activity Factor指標反応の活性比で組換え系とヒト肝を橋渡しする相対活性係数。ISEFと同系統の換算補正。＝相対活性係数指標反応の活性比で組換え系とヒト肝を橋渡しする相対活性係数。ISEFと同系統の換算補正。）と呼ばれる指標反応の活性比で組換え系と肝を橋渡しする補正も、同じ系統の考え方です。ISEFとRAF指標反応の活性比で組換え系とヒト肝を橋渡しする相対活性係数。ISEFと同系統の換算補正。はいずれも「組換え系の数字をヒト肝に読み替える」ための係数であり、換算の立て方が違います。

実務では、これら三つを別々に走らせ、答えが揃うかを確認するのが要点です。当局のガイダンスも、化学阻害剤法とrCYPの少なくとも二つのアプローチを併用し、結果の整合を確かめることを求めています。三法が食い違うときの読み解き方の例を挙げます。

実際に、rCYPだけではCYP2C8/2C9/2D6が主に見えたのに、HLM＋阻害剤ではCYP3Aが主経路と分かり、そちらが臨床データと一致した、という報告もあります。単一手法に頼らないのは、こうした取り違えを避けるためです。

fmがDDIリスク評価に効く理由

fmが効いてくるのは、DDIの大きさが「阻害される経路が代謝全体に占める割合」で決まるからです。ある分子種のfmが大きいほど、その分子種を止める併用薬による血中濃度の上昇幅は大きくなります。fmが小さければ、その経路を完全に止めても影響は限定的です。

当局の運用では、ある分子種の寄与が代謝の概ね25%（fmがおよそ0.25以上）を超える場合、その分子種の強力な阻害剤・誘導剤核内受容体などを介してトランスポーターや酵素の発現量そのものを増やす薬。効果が薄れる方向に働く。を用いた臨床DDI試験を検討するという目安が示されています。一方、fmが単一分子種で概ね0.9を超えるような化合物は、その一経路にDDIリスクが集中するため、注意して評価します。

fmは非臨床の肝ミクロソーム固有クリアランスから積み上げた消失像の一部でもあります。代謝が消失に占める割合と、その中のfmの内訳が揃って初めて、DDIの臨床的な意味が見えてきます。 fmはDDI試験を組むかどうかの判断基準そのものであり、寄与率の確からしさが臨床試験の設計を左右します。

まとめ

CYP reaction phenotypingの目的は、各CYP分子種CYP3AやCYP2D6など、薬物代謝を担うシトクロムP450の個々の酵素種。基質ごとに寄与が異なる。の寄与率fmある分子種がその化合物の代謝のうち何割を担うかを表す割合。全分子種の合計が1になるよう定義する。を確からしいかたちで求めることにあります。選択的化学阻害剤法、rCYP＋ISEF、相対存在量法の三つはそれぞれ前提と弱点が違い、単独では取り違えが起こりえます。だからこそ複数手法を併用し、整合を確認する手順が要になる。求めたfmは、代謝が消失に占める割合とあわせて読むことで、臨床DDI試験を組むかどうかの判断につながります。

参考文献

• FDA, In Vitro Drug Interaction Studies — Cytochrome P450 Enzyme- and Transporter-Mediated Drug Interactions Guidance for Industry
• ICH M12薬物相互作用試験の判断基準を日米欧で揃えた国際整合ガイドライン。in vitroから臨床試験の要否を判断する。, Drug Interaction Studies
• EMA, ICH M12 on drug interaction studies — Scientific guideline
• FDA, Clinical Drug Interaction Studies — Cytochrome P450 Enzyme- and Transporter-Mediated Drug Interactions Guidance for Industry