in vitro 小核試験(CBMN法)とは？ サイトカラシンBと判定の基礎

in vitro小核試験は、この小核の出現頻度を培養細胞で評価する遺伝毒性試験です。医薬品開発では、Ames試験（細菌の遺伝子突然変異）と組み合わせ、標準的な遺伝毒性バッテリーの染色体傷害を担う一角として使われます。ICH S2(R1)でも、小核試験は染色体異常を検出する選択肢のひとつとして位置づけられています。

本稿では、サイトカラシンB法（CBMN法）を軸に、なぜ二核細胞を作るのか、どう計数し、CBPIやRIで細胞毒性をどう補正するのか、そしてOECD TG487での陽性判定と、従来の染色体異常試験との使い分けまでを整理します。

小核が語ること：構造異常と数的異常をまとめて拾う

小核試験の強みは、二種類の異なる異常を一つの計数で拾える点にあります。

• 構造異常（クラストゲン作用）：染色体が切断され、動原体を持たない断片が生じます。この断片は次の分裂で娘核に引き込まれず、小核として取り残されます。
• 数的異常（アニュージェン作用）：紡錘体や動原体の機能が乱れ、染色体が一本まるごと分配に失敗します。この染色体も小核になります。

つまり小核は、切断（クラストゲン）と分配ミス（アニュージェン）という異なる作用機序の結果を、まとめて可視化してくれます。染色体を一本ずつ観察する染色体異常試験に比べ、判定が客観的で数えやすく、多くの細胞を評価しやすいことが実務上の利点です。 小核試験は構造異常と数的異常の両方を一つの指標で捉えられる点に価値があります 。

なお、小核が断片由来（クラストゲン）か染色体丸ごと由来（アニュージェン）かは、動原体やセントロメアを染め分けることで区別できます。抗キネトコア抗体（CREST）やセントロメアFISHで小核内のシグナルの有無を見る方法が知られており、必要に応じて作用機序の切り分けに使われます。

サイトカラシンBで二核細胞を作る意味

小核は「分裂を一度終えた細胞」で数える必要があります。分裂していない細胞の細胞質を見ても、そこにある核異常は今回の処理で生じたものとは限らないためです。ここでサイトカラシンBが効いてきます。

サイトカラシンBは、細胞質分裂（サイトカイネシス）に必要なアクチン繊維の働きを妨げます。核分裂（有糸分裂）は進むのに、細胞がくびれて二つに分かれる最後の段階が止まるため、分裂を一度終えた細胞は核を二つ持った二核細胞として残ります。

この二核細胞だけを選んで小核を数えれば、「処理の期間中あるいは直後に、たしかに一度分裂した細胞」に評価対象を限定できます。まだ分裂していない単核細胞や、二回以上分裂した多核細胞と区別できるため、小核頻度の解釈が明確になります。この細胞質分裂ブロック法を用いる小核試験を、CBMN法（Cytokinesis-Block Micronucleus）と呼びます。

サイトカラシンBを使わない方法（非CBMN法）も認められています。この場合は細胞増殖が十分に起きたことを別の指標で示す必要があり、二核細胞という明確な目印がない分、増殖の確認方法に注意が要ります。

二核細胞の計数と、細胞毒性の補正

CBMN法では、二核細胞を対象に小核の有無を観察します。OECD TG487では、CBMN法の場合、各濃度・対照あたり少なくとも2000個の二核細胞で小核を計数することが目安とされています。二核細胞あたり複数の小核が見えることもあり、小核を持つ細胞の割合として集計するのが一般的です。

問題は、細胞毒性が強い濃度では話が変わることです。毒性で増殖が抑えられた集団では、傷ついた細胞が分裂に至らず脱落し、見かけの小核頻度が実態とずれることがあります。逆に、細胞毒性そのものが小核を誘発する二次的な機序もあるため、どこまでの毒性で試験を成立させるかを決めておく必要があります。そこで用いるのが細胞増殖の指標です。CBMN法では主に次の二つが使われます。

これらから細胞毒性（細胞増殖抑制、cytostasis）を求めます。CBPIを使う場合、細胞増殖抑制率は概ね次のように表されます。

細胞増殖抑制率（％） ＝ 100 － 100 × （処理群のCBPI － 1） ÷ （対照群のCBPI － 1）

RIを使う場合は、処理群と対照群の複製指数の比から抑制率を出します。OECD TG487では、最高濃度での細胞毒性の目安として、これらの指標で概ね55 ± 5％程度の細胞増殖抑制に相当する濃度を上限とすることが推奨されています。 CBPIやRIで細胞毒性を数量化し、規定の範囲に収めることが、小核頻度を正しく読むための前提になります 。

OECD TG487での陽性判定

判定は、小核を持つ二核細胞の頻度が濃度に応じて意味のある増加を示すかどうかで行います。OECD TG487の考え方では、次のいずれも満たすとき陽性と評価するのが一般的です。

• 少なくとも一つの濃度で、同時対照に対して統計的に有意な小核頻度の増加がある
• 適切な傾向検定で、濃度に依存した増加が認められる
• 得られた値が、その施設の陰性対照（背景）データの分布範囲を超えている

これらを満たさず、いずれの濃度でも増加が見られなければ陰性と判断します。判定が曖昧なときは、条件を変えた追試で確認します。試験の妥当性は、陰性・陽性・溶媒対照が期待どおりに振る舞ったか、代謝活性化系（S9）の有無を含めて成立要件を満たしたか、で担保されます。

代謝活性化については、生体内では代謝を受けてはじめて遺伝毒性を示す物質があるため、S9存在下・非存在下の両条件を評価するのが基本です。この点はAmes試験と共通する考え方です。

染色体異常試験との使い分け

小核試験と、従来の**染色体異常試験（OECD TG473）**は、どちらも染色体レベルの傷害を見る点で近い試験ですが、見えるものと得意分野が異なります。

小核試験は、数的異常（アニュージェン）を拾いやすく、多数の細胞を効率よく評価できるのが強みです。一方、染色体異常試験は、切断や交換といった構造異常の型まで詳細に観察できます。ICH S2(R1)の遺伝毒性バッテリーでは、in vitroの染色体傷害を見る試験として小核試験か染色体異常試験のいずれかを選べるとされており、目的や運用に応じて選択されます。

作用機序をさらに追う場合は、DNA鎖切断そのものを個々の細胞で見るコメット試験を組み合わせる選択肢もあります。小核試験が「分裂を経た結果としての染色体異常」を見るのに対し、コメット試験は「切断された鎖の存在」を直接見るため、両者は補完的です。

まとめ

in vitro小核試験（CBMN法）は、サイトカラシンBで細胞質分裂を止めて二核細胞を作り、その細胞に残る小核を数えることで、染色体の構造異常（クラストゲン）と数的異常（アニュージェン）をまとめて評価する試験です。CBPIやRIで細胞毒性を数量化し、概ね55 ± 5％程度の細胞増殖抑制を上限の目安に収めたうえで、統計的有意性・濃度依存性・背景データとの比較から陽性・陰性を判定します。染色体異常試験とは検出の得意分野が異なり、目的に応じて選び分けたり、コメット試験と組み合わせたりして、遺伝毒性の全体像を組み立てていきます。

参考文献

• OECD, Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test
• OECD, Test No. 473: In Vitro Mammalian Chromosomal Aberration Test
• OECD, Test No. 471: Bacterial Reverse Mutation Test
• ICH, S2(R1): Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use
• FDA, Guidance for Industry: S2(R1) Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use