Ames試験の菌株選択と判定基準：TA98・TA100・S9の読み方

読みどころは、どの菌株を選び、代謝活性化（S9 mix）を入れるか入れないか、そして増えたコロニーをどこから陽性と見るか、の三点に集約されます。菌株ごとに得意な変異のタイプが違い、代謝で初めて変異原になる化合物もあるため、組み合わせを外すと「陰性に見えるだけ」の見落としが起こります。

本稿では、標準的に使う5菌株の担当、±S9の意味、陽性判定の考え方を整理し、OECD TG471やICH M7・S2(R1)のなかでAmes試験がどこに置かれるかまでを見ていきます。

何を測っているのか：復帰突然変異という仕組み

Ames試験で使う菌株は、アミノ酸合成に関わる遺伝子をあらかじめ壊してあります。サルモネラ菌ではヒスチジン合成遺伝子(his)、大腸菌ではトリプトファン合成遺伝子(trp)です。これらの菌は、そのアミノ酸を欠いた培地では増えません。

ここに被験物質を加え、壊れた遺伝子に変異が入って合成能が復帰すると、アミノ酸なしの培地でも増えてコロニーを作ります。この復帰コロニー（revertant）を数え、溶媒対照（自然に復帰する分）と比べて、被験物質が変異を増やしたかを判断します。

菌株には感度を上げる工夫も入っています。細胞壁を弱めるrfa（大きな分子を通しやすくする）、DNA修復を欠かせるuvrB（損傷が残りやすくする）、一部の菌株が持つpKM101プラスミド（変異を起こしやすくするエラー修復を強める）などです。これらのおかげで、微量の変異原でも検出しやすくなっています。 Ames試験は、壊した遺伝子が復帰する向きを数えて変異原性を見る系 です。

標準5菌株の担当：塩基置換型とフレームシフト型

点突然変異には大きく二つの型があります。一つは塩基が入れ替わる塩基置換型、もう一つは塩基が挿入・欠失して読み枠がずれるフレームシフト型です。菌株はこの型ごとに感度が分かれており、両方を捉えるために複数を組み合わせます。

OECD TG471で推奨される標準的な組み合わせは、サルモネラ菌4株と大腸菌1株です。

TA1537の代わりにTA97やTA97aを、WP2 uvrAの代わりにTA102を使う構成も認められています。いずれにせよ、塩基置換型とフレームシフト型の両方をカバーする5株を組む のが基本です。

代謝活性化（±S9 mix）の意味

化合物のなかには、それ自体は変異原ではなく、体内で代謝されて初めて変異原性を持つものがあります。この「代謝で生じる活性体」を細菌の系で再現するのがS9 mixです。

S9は、肝臓のホモジネートを遠心して得る上清（9,000×g上清）で、薬物代謝酵素（P450など）を含みます。実務では、Aroclor 1254やフェノバルビタール／β-ナフトフラボンで酵素を誘導したラット肝から調製したものが広く使われます。これにNADPHを供給する補酵素系（グルコース-6-リン酸やNADPなど）を加えて、代謝反応を回します。

試験はS9ありとS9なしの両条件で行います。これは次の切り分けのためです。

つまりS9の有無は、「もとの分子が効いたのか、代謝物が効いたのか」を読み分ける鍵になります。 ±S9の両条件を置くことで、代謝活性化を要する変異原の見落としを防げます 。なお、化合物を菌とS9に先に接触させる前培養法(preincubation)と、寒天に一緒に混ぜる平板法(plate incorporation)があり、代謝活性化を要する一部の化合物では前培養法のほうが感度が高いとされます。

陽性判定の考え方：2倍法・用量依存・再現性

コロニーが増えれば即陽性、とはしません。判定は主に三つの観点を組み合わせます。

• 一定倍以上の増加：溶媒対照に対して、復帰コロニーが決められた倍率以上に増えているか。菌株によって概ね2倍または3倍が目安とされ、自然復帰数の多いTA100などは2倍、少ない菌株は3倍を使う運用が一般的です。
• 用量依存性：用量を上げるにつれてコロニー数が増える傾向（濃度依存の増加）があるか。単発のスパイクは、毒性や実験誤差と区別しにくいためです。
• 再現性：同じ結果が再現するか。弱い増加や2〜3倍の境界域(equivocal)では、独立した反復試験で確認します。

これらを満たす、用量依存的で再現性のある明確な増加があれば陽性と判断します。逆に、最高用量まで増加がなければ陰性です。ただし陰性と言うには、菌に対する毒性で菌が死んで見かけ上増えていないだけ、という状況を除外する必要があります。 陽性判定は「一定倍以上の増加・用量依存・再現性」を合わせて見るのが基本 です。

最高用量の置き方にも決まりがあります。細胞毒性が出る用量まで、あるいは溶解度・沈殿の限界まで上げるのが原則で、毒性も溶解限界もなければ概ね5,000μg/plate程度を上限の目安とする運用が知られています。用量の刻み方（スペーシング）が粗いと、増加のピークを取り逃すことがあります。

ガイドラインでの位置づけ：OECD TG471とICH

Ames試験は、遺伝毒性評価の入り口として各ガイドラインに組み込まれています。試験法そのものはOECD TG471（細菌復帰突然変異試験）が標準です。

医薬品では、ICH S2(R1)が遺伝毒性試験の標準組み合わせを定めており、そのなかでAmes試験は必須の1試験に位置づけられます。全菌株を±S9で走らせ、適切な用量範囲と対照を置いた「十分な protocol」で明確に陰性または陽性なら、細菌変異の評価は原則としてこの1試験で足りるとされます。染色体レベルの損傷は小核試験（in vitro CBMN法）などの別アッセイが担い、Ames試験は遺伝子（点突然変異）レベルを受け持ちます。

不純物の管理では、ICH M7がDNA反応性（変異原性）不純物の評価を規定しています。ここでは構造アラート（構造から変異原性を疑う指標）による(Q)SAR評価と、Ames試験の実測が組み合わされます。構造上の懸念があっても、適切に実施したAmes試験が陰性であれば懸念を打ち消せる、という位置づけです。ただしニトロソアミンのような不純物では、S9の由来や前培養法の採用など試験設計の影響が大きいことが指摘されており、条件依存に注意が要ります。

なお、Ames試験で捉えるのは変異という「不可逆な結果」です。DNA鎖切断のような損傷そのものを見たい場合は、コメットアッセイなどの別系が補完的に使われます。目的に応じてアッセイを選び分けるのが実務の勘どころです。

まとめ

Ames試験は、壊した遺伝子の復帰を数えて点突然変異を見る、遺伝毒性評価の入り口です。TA98（フレームシフト型）とTA100・TA1535（塩基置換型）を軸にした5菌株で両方の変異型をカバーし、S9の有無で親化合物と代謝物の効き方を読み分けます。判定は一定倍以上の増加・用量依存・再現性を合わせて見て、境界域は反復で確認します。OECD TG471を試験法の標準に、ICH S2(R1)では必須の1試験、ICH M7では不純物評価の実測として、それぞれの文脈で使われています。菌株選択とS9の設計を外さないことが、見落としのない評価の前提になります。

参考文献

• OECD, Test Guideline No. 471: Bacterial Reverse Mutation Test
• OECD, Test Guideline No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test
• ICH, S2(R1): Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use
• ICH, M7(R2): Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk
• FDA, Template for In Vitro Bacterial Reverse Mutation (Ames) Test
• EMA, ICH guideline S2 (R1) on genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals intended for human use