HILIC（糖鎖プロファイル分析）

HILICは、移動相中の有機溶媒（主にアセトニトリル）の比率を高くした条件で、固定相表面の水和層と糖鎖の親水性基との相互作用を利用して保持・分離するモードです。糖鎖は親水性が高いほど強く保持されるため、シアル酸やガラクトース、マンノースの数が多い構造ほど遅く溶出し、おおむね糖の数や極性の順にピークが並びます。固定相にはアミド系（amide／glycan BEH amideなど）のカラムが広く使われ、検出はFLR（蛍光）またはMSで行います。

分析の前処理として、まずPNGase FでN型グリカンをタンパク質骨格から酵素的に遊離し、還元末端を蛍光標識します。標識試薬は古くから使われる2-AB（2-aminobenzamide、還元アミノ化）と、より迅速でMS感度の高いRapiFluor-MSやInstantPCなどがあり、目的（FLRのみか、FLR-MSでの構造同定も行うか）に応じて選びます。標識後はクリーンアップで余剰試薬を除き、HILICアミドカラムに注入してグラジエント溶出します。

得られたクロマトグラムの各ピークを積分し、主要グリコフォーム（G0F・G1F・G2F・高マンノース・シアリル種・アフコシル化体など）の相対面積%を算出します。FLRは定量性・再現性に優れ規格試験に向き、MSはグルコースユニット（GU値）と併せた構造同定に役立ちます。インタクト／サブユニットLC-MSが分子全体のグリコフォーム分布を見るのに対し、HILIC（放出糖鎖）は個々のグリカン構造を高分離で定量する相補的な手法で、エキソグリコシダーゼ消化と組み合わせれば構造帰属の確度を上げられます。