鋳型DNAの直鎖化
環状プラスミド鋳型を制限酵素で直鎖化し、ラントオフ転写で全長mRNAを得る前処理に使う。
主な用途
- 鋳型前処理
- 直鎖化
Product Guide
IVT用酵素・試薬（T7・NTP・DNase）
IVT用酵素・試薬は、mRNA医薬の核となるin vitro転写（IVT）反応を構成する原材料群です。鋳型DNAから一本鎖RNAを合成するT7 RNAポリメラーゼ、基質となるNTP（修飾NTPを含む）、環状鋳型を直鎖化する制限酵素、転写後に鋳型DNAを除去するDNaseなどを含みます。配列正確性・収量・不純物プロファイルを左右し、GMPグレードと性能が選定の鍵になります。
用途・特徴
IVT反応は、直鎖化した鋳型DNAのT7（またはSP6・T3）プロモーター下流をRNAポリメラーゼが転写し、NTPを基質に一本鎖RNAを合成する反応です。N1-メチルシュードウリジン（m1Ψ）などの修飾NTPを用いると、免疫原性の低減と翻訳効率の向上が期待できます。酵素・試薬の品質が、全長収量、二本鎖RNA（dsRNA）副生成物、中断配列、残存DNAといった不純物プロファイルを直接左右します。
選定では、グレード（研究用／GMP）、エンドトキシン・ヌクレアーゼ・残存宿主由来不純物の規格、酵素の比活性とロット間再現性、修飾NTPの取り込み効率、鋳型直鎖化に使う制限酵素の認識配列とスター活性、DNaseの完全分解性とRNAへの影響を確認します。トレーサビリティとDMF・規格書などの規制サポートも重要です。
工程設計では、IVT反応条件（酵素・NTP・Mg2+・温度・時間）の最適化に加え、Cappingストラテジー（共転写キャップ vs 酵素的キャップ）との整合、転写後のDNase処理とその後の精製（dsRNA除去・NTP/酵素除去）まで一連で考えます。連続生産や大スケールでは、原材料の供給安定性とコストも設計要素になります。
Point
- 鋳型DNAからmRNAを合成するIVT反応の中核原材料
- T7 RNAポリメラーゼが主流（SP6・T3も用途あり）
- 修飾NTP（m1Ψなど）で免疫原性低減・翻訳効率向上を図る
- 鋳型直鎖化用の制限酵素、転写後の鋳型分解用DNaseを含む
- 全長収量・dsRNA副生成物・残存DNAなど不純物プロファイルを左右する
- 研究用とGMPグレードで規格・トレーサビリティが大きく異なる
- エンドトキシン・残存ヌクレアーゼ・ロット間再現性が選定軸
- Capping・精製工程との整合を含めた一貫設計が重要
使用方法
基本的には、鋳型DNAを直鎖化し、T7 RNAポリメラーゼとNTPでIVT反応を行い、DNase処理後に精製してmRNAを回収します。
1プラスミド鋳型を制限酵素で直鎖化する
2直鎖化DNAを精製し純度・直鎖化率を確認する
3T7 RNAポリメラーゼ・NTP（修飾NTP含む）・緩衝液を調製する
4IVT反応を実施しmRNAを合成する
5DNaseで鋳型DNAを分解・除去する
6精製後に収量・純度・dsRNAなどを評価する
実際の条件は、配列、修飾NTPの種類、Cappingストラテジー、スケール、GMP要件、後続精製との整合によって変わります。
使用される工程
IVT用酵素・試薬は、mRNA原薬製造の上流工程と品質設計で中心的に使われます。
in vitro転写（IVT）
T7 RNAポリメラーゼとNTP（修飾NTP含む）を用いてmRNAを合成する中核反応に使う。
主な用途
- mRNA合成
- 修飾NTP取り込み
転写後の鋳型分解
DNaseで残存鋳型DNAを分解し、残存DNA規格を満たすための除去に使う。
主な用途
- 鋳型除去
- 残存DNA低減
プロセス開発・最適化
酵素・NTP・Mg2+・反応条件を調整し、収量・全長率・dsRNAなどを最適化する検討に使う。
主な用途
- 条件最適化
- 不純物制御
使用されるモダリティー
IVT用酵素・試薬は、mRNAやIVT由来RNAを用いるモダリティーで特に重要です。
mRNA-LNP
関連度高
IVT反応修飾NTP鋳型直鎖化DNase処理
mRNAワクチン・治療薬の原薬合成の中核として使われる。
自己増幅型mRNA（saRNA）
関連度高
長鎖IVT全長収量dsRNA制御
長鎖RNA合成でポリメラーゼ性能と不純物制御が重要になる。
プラスミドDNA
関連度中〜高
鋳型供給直鎖化残存DNA評価
IVT鋳型として供給され、直鎖化・残存評価で関係する。
ワクチン
関連度中〜高
mRNAワクチン原薬IVT修飾NTP
mRNAワクチンの原薬製造で中心的に使われる。
siRNA・アンチセンス核酸
関連度低〜中
IVT系評価RNA基質調製
化学合成が主流で、IVTは補助的な用途にとどまる。
メーカー製品
Thermo Fisher ScientificTheraPure / GMP T7 RNA Polymerase・NTPmRNA製造向けにGMPグレードのT7ポリメラーゼ・NTP・修飾NTPなどIVT原材料を供給。公式URL New England BiolabsHiScribe T7 / GMP-grade IVTリエージェントT7 RNAポリメラーゼ、IVTキット、制限酵素、DNase Iなどを研究用・GMPグレードで提供。公式URL Merck (Sigma-Aldrich)GMPグレードIVT酵素・ヌクレオチドT7ポリメラーゼ、NTP、修飾NTP、DNaseなどをGMPグレードで供給し規制サポートを提供。公式URL PromegaT7 RNA Polymerase / RQ1 RNase-Free DNaseIVT用RNAポリメラーゼやRNaseフリーDNaseなど転写関連酵素を提供。公式URL Aldevron (Danaher)GMP mRNA原材料・酵素mRNA製造向けの直鎖化鋳型・酵素・試薬を含むIVTワークフロー材料を供給。公式URL Roche (Kapa / Custom Biotech)IVT用酵素・ヌクレオチド原材料mRNA製造向けにポリメラーゼ・ヌクレオチド・酵素原材料を提供。公式URL
