細胞株開発・クローン選抜
導入遺伝子コピー数、クローン比較、遺伝子編集確認に使われる。
主な用途
- コピー数
Product Guide
デジタルPCR装置
デジタルPCR装置は、核酸サンプルを多数の微小区画に分割し、各区画でPCRを行うことで核酸を高精度に絶対定量する装置です。区画ごとの陽性・陰性をポアソン統計で数えるため、標準曲線なしで定量しやすく、低コピー数や微小な差の検出、AAVゲノム力価などに強いことが特徴です。
用途・特徴
デジタルPCR装置は、核酸を高感度かつ高精度に定量するために使われます。リアルタイムPCRよりも、微量核酸、低コピー数、希少変異、コピー数変化、ベクターコピー数、AAVゲノム力価などの測定に向いています。
AAV製造ではベクターゲノムの定量、細胞治療では遺伝子導入細胞のベクターコピー数や残存ウイルス関連試験、抗体医薬では残存DNAや細胞株コピー数確認などで使われる場合があります。
Point
- 標準曲線なしで核酸の絶対定量ができる
- 低コピー数や微小な差の検出に強い
- AAVゲノム力価やベクターコピー数測定に使われる
- 残存DNA、ウイルス核酸、低頻度変異、コピー数解析に使われる
- リアルタイムPCRより高精度な定量が必要な場面で選ばれる
- ドロップレット型、チップ型、ナノプレート型などがある
使用方法
基本的には、サンプルから核酸を抽出し、反応液を調製して、サンプルを微小区画に分割してPCR反応を行います。
1サンプルを採取し、核酸を抽出する
2必要に応じて逆転写を行う
3プライマー・プローブ・マスターミックスを調製する
4ドロップレット／チップ／ナノプレートに分割する
5PCR反応を行う
6各区画の蛍光シグナルを読み取る
7コピー数・濃度・変異率を算出する
実際の条件は、測定対象、サンプル前処理、区画化方式、プライマー・プローブ設計、装置方式、蛍光チャンネル数、解析ソフト、GMP対応、バリデーション要件によって変わります。
リアルタイムPCRとの違いは？
どちらも核酸定量に使われますが、定量方法が異なります。
結論
リアルタイムPCRは汎用的な核酸定量に向き、デジタルPCRはより高精度な絶対定量や希少なターゲットの検出に向きます。
定量方法
Ct値と標準曲線から推定
陽性/陰性区画数から絶対定量
標準曲線
基本的に必要
不要な場合が多い
感度
高い
非常に高い
精密性
良好
低コピー数や微小差に強い
主な用途
マイコプラズマ、残存DNA、遺伝子発現、工程管理
AAV力価、コピー数、低頻度変異、微量核酸
コスト
比較的導入しやすい
装置・消耗品コストが高め
ドロップレット型とチップ型の違い
| 項目 | ドロップレット型 | チップ型・ナノプレート型 |
|---|---|---|
| 区画化方式 | 油中に多数の液滴を作る | チップやプレート上の微小区画に分配する |
| 代表例 | Droplet Digital PCR | チップ型dPCR、ナノプレート型dPCR |
| 強み | 多数の区画を作りやすい | ワークフローを統合しやすい |
| 注意点 | ドロップレット作製・読み取り工程が必要 | 専用チップ・プレートが必要 |
| 向く用途 | 低頻度変異、コピー数、絶対定量 | QC、臨床研究、ワークフロー簡略化 |
主な測定対象
| 測定対象 | 内容 | 主な用途 |
|---|---|---|
| AAVゲノム力価 | AAV中のベクターゲノムコピー数を測定する | AAV品質評価、工程管理 |
| ベクターコピー数 | 細胞中に導入されたベクターコピー数を測定する | CAR-T、レンチウイルス、遺伝子導入細胞 |
| 残存DNA | 宿主細胞由来DNAやプラスミドDNAを定量する | 抗体医薬、AAV、mRNA原料 |
| コピー数変化 | 遺伝子コピー数やCNVを解析する | 細胞株開発、遺伝子編集 |
| 低頻度変異 | 少数の変異アリルを検出する | 腫瘍解析、遺伝子編集評価 |
| ウイルス核酸 | ウイルス由来核酸を検出・定量する | ウイルス安全性、RCL/RCA確認 |
選定ポイント
区画化方式ドロップレット型、チップ型、ナノプレート型のどれか
区画数1反応あたりのパーティション数が十分か
蛍光チャンネルFAM、HEX、VIC、Cy5など必要な色素／マルチプレックスに対応するか
感度・精度低コピー数、低頻度変異、コピー数差を検出できるか
ワークフロー区画化、PCR、読み取り、解析がどこまで統合されているか
GMP対応監査証跡、ユーザー権限、電子署名、データ出力に対応するか
自動化分注装置、核酸抽出、LIMSとの連携が可能か
使用される工程
デジタルPCR装置は、高精度な核酸定量が必要な工程で使われます。
セルバンク
細胞同一性確認、ウイルス安全性試験、コピー数確認に関係する。
主な用途
- 安全性確認
本培養・ハーベスト
AAV/レンチウイルスのゲノムコピー、未精製バルク中の核酸確認に関係する。
主な用途
- ゲノムコピー
下流精製・UF/DF
残存DNA、ベクターゲノム、工程中間体の核酸定量に使われる。
主な用途
- 残存DNA
品質評価・分析
AAVゲノム力価、VCN、残存DNA、低頻度変異、コピー数解析に使われる。
主な用途
- AAV力価
- VCN
GMP品質管理
規格試験、工程内管理、出荷試験、逸脱調査に使われる場合がある。
主な用途
- 規格試験
使用されるモダリティー
デジタルPCR装置は、核酸定量が重要なモダリティーで特に使われます。
AAV
関連度高
ゲノム力価残存DNARCA確認
AAV品質評価で重要な核酸定量装置として使われる。
レンチウイルス
関連度高
ベクターコピー数RCL確認
細胞治療用ベクターの品質確認に使われる。
細胞治療
関連度高
ベクターコピー数遺伝子導入確認残存ウイルス
CAR-Tなどの品質管理で使われる。
遺伝子編集
関連度高
編集効率コピー数低頻度変異
CRISPR編集細胞の評価に使われる。
プラスミドDNA
関連度高
コピー数残存宿主DNA
プラスミド製造や原材料品質評価に関係する。
抗体医薬
関連度中〜高
残存DNAコピー数確認
qPCRの補完として高精度定量に使われる場合がある。
ADC
関連度中〜高
CHO細胞残存DNA
抗体部分の製造細胞・品質確認で関係する。
Fc融合・組換えタンパク質
関連度中〜高
産生細胞残存DNA
製造細胞や原薬の核酸定量に使われる。
mRNA-LNP
関連度中〜高
残存DNARNA関連評価
mRNA製造やLNP評価の周辺品質確認に関係する。
iPS細胞・幹細胞由来製品
関連度中〜高
遺伝子編集確認コピー数
細胞品質確認や安全性評価で使われる。
ワクチン
関連度中〜高
ウイルス核酸細胞基材
品質試験や工程管理に関係する。
メーカー製品
デジタルPCR装置（4）
Bio-RadQX600 / QX600 AutoDG / QX ONE Droplet Digital PCRDroplet Digital PCRシステム。6色マルチプレックス解析、コピー数解析、低頻度変異、絶対定量に使われる。公式URL Thermo Fisher Scientific / Applied BiosystemsQuantStudio Absolute Q Digital PCR Systemマイクロ流体アレイプレート技術を用い、1台にワークフローを統合したデジタルPCR。絶対定量・希少変異検出に使われる。公式URL QIAGENQIAcuity Digital PCR Systemナノプレート型のデジタルPCR。パーティショニング・サーマルサイクル・イメージングを統合し、CNV、変異検出、遺伝子編集解析に使われる。公式URL Stilla Technologiesnaica systemCrystal Digital PCR技術を用いたデジタルPCR。マルチプレックス解析、希少変異検出、細胞治療関連解析で使われる。公式URL
デジタルPCR試薬・マスターミックス（4）
Bio-RadddPCR Supermix for Probes / EvaGreen / Multiplexプローブ法・EvaGreen法・マルチプレックスddPCRに使われるマスターミックス。コピー数解析、変異検出、絶対定量に使われる。公式URL Thermo Fisher Scientific / Applied BiosystemsAbsolute Q DNA / RNA Digital PCR Master MixQuantStudio Absolute Qで使われるデジタルPCR用マスターミックス。DNA/RNAターゲットの絶対定量に使われる。公式URL QIAGENQIAcuity Probe / EG PCR KitQIAcuity用のプローブ／EvaGreenベースdPCRキット。変異検出、コピー数、遺伝子発現解析に使われる。公式URL Stilla Technologiesnaica PCR Mixes / Crystal Digital PCR Reagentsnaica system向けのdPCR試薬。マルチプレックス解析や核酸定量に使われる。公式URL
AAV・ウイルスベクター定量キット（4）
Bio-RadAAV Titration by ddPCR ApplicationsddPCRを用いたAAVベクターゲノム力価測定に関係するアプリケーション。AAV品質評価で使われる。公式URL QIAGENQIAcuity AAV Titer ApplicationsQIAcuityを用いたAAVゲノム定量、コピー数解析、ウイルスベクター関連解析に使われる。公式URL Takara BioAAVpro Titration Kit関連製品AAVベクターの力価測定や関連解析に使われる試薬群。公式URL ProgenAAV Titration / Reference MaterialsAAVカプシド力価測定や参照用途の製品。dPCRによるゲノム力価測定と組み合わせて評価される。公式URL
核酸抽出・前処理装置（3）
データ解析・LIMS連携（3）
受託試験・解析サービス（4）
Eurofins BioPharma Product TestingdPCR / qPCR / Residual DNA Testingバイオ医薬品品質試験、残存DNA、分子生物学的試験に対応する受託試験サービス。公式URL Charles River LaboratoriesMolecular Biology / Viral Safety Testingバイオ医薬品・細胞治療向けの分子生物学的試験、ウイルス安全性試験に対応する。公式URL GenScript ProBioAAV / Cell & Gene Therapy Analytical ServicesAAVや細胞・遺伝子治療関連の分析、力価、品質試験に関係する受託サービス。公式URL VectorBuilderAAV / Lentivirus Titer Testing ServicesAAV、レンチウイルスベクターの力価測定や品質評価に関係するサービス。公式URL
