残存DNAとは？抗体医薬における宿主細胞由来DNAの評価とqPCR分析

ここで押さえておきたいのは、これが抗体そのものの変化ではないという点です。凝集体や断片が抗体自身から生じるのに対し、残存DNAは製造工程から持ち込まれる工程由来不純物にあたります。だからSEC-HPLC多孔質の担体を通る時間差で分子をサイズ順に分離し、抗体の凝集体や断片がどれくらい含まれるかを測る手法です。詳しく →やCE-SDSSDSで処理したタンパク質をキャピラリー電気泳動で分離し、抗体などの純度や分子サイズ分布（断片・凝集）を評価する手法です。詳しく →で見る「純度製品にどれだけ目的物質だけが含まれ、不純物や変性体が少ないかを示す指標です。抗体では単量体の割合やサイズの異なる成分の量などを見ます。詳しく →」とは切り離して、別の分析項目として管理されます。評価には主に 残存DNA定量（qPCR） や デジタルPCR（dPCR） を使い、宿主細胞由来DNA製造に使った宿主細胞に由来するDNAの不純物です。安全性の観点から、精製後にどれだけ残っているかを測る試験です。詳しく →を高感度に検出・定量して、精製工程で十分に除去されているか、製品中の残存量が管理範囲にあるかを確かめます。

しかも管理の軸は量だけではありません。「DNAの断片サイズ」と「1投与量あたりの残存量」という二つの見方が効いてきます。一般には残存DNA量は 10 ng/dose 以下、断片サイズは 200 bp 程度以下という考え方が広く参照されてきました。つまり、たとえ総量がわずかでも、断片が長ければ評価は変わりうる——残存DNAは、量とサイズをセットで読んではじめて意味をなす管理項目品質に影響しうる要素を、規格や手順で規定し・実行し・記録し・検証する対象として管理するもの。GMPでは原材料から出荷判定まで多岐にわたります。詳しく →なのです。

残存DNAとは何か

残存DNAとは、バイオ医薬品抗体・タンパク質・核酸など生体由来の分子を利用して製造された医薬品の総称。の製造に使われる宿主細胞に由来し、最終的な原薬原薬。精製を終えた有効成分そのもので、製剤化する前の段階を指す。や製剤製剤。原薬を処方・充填して、最終的な投与形態に仕上げた製品。中に微量に残るDNAのことです。

抗体医薬では、CHO細胞などの哺乳類細胞を使って目的抗体を産生することが多くあります。細胞培養後、ハーベスト、清澄化、Protein A精製抗体に特異的に結合するProtein Aを担体に固定し、抗体だけを選択的に捕まえて精製する手法です。抗体医薬の最初の精製工程として定番になっています。詳しく →、ウイルス不活化精製の途中で液を一定時間低いpHにさらし、混入しうるエンベロープウイルスを不活化するウイルス安全対策です。詳しく →、ポリッシング、UF / DF半透膜で濃縮するUFと、バッファーを置換するDFを組み合わせ、原薬の濃度と処方を整える工程。などの工程を通じて目的抗体を精製します。一連の流れは 抗体の工程フロー で工程順に確認できます。

この過程で、宿主細胞由来タンパク質であるHCP、宿主細胞由来DNA、培地成分、Protein AリークProtein Aアフィニティ精製で漏れ出したProtein Aの残存量を測るELISAです。精製由来の不純物として管理するために使います。詳しく →などの工程由来不純物mRNA製造などで生じる二本鎖RNA(dsRNA)や鋳型DNAなど、製造工程に由来する不純物の残存量を調べる試験です。詳しく →を除去していきます。

残存DNAは、抗体そのものの変化ではなく、 製造に使った細胞から持ち込まれる不純物 です。そのため、抗体医薬の品質評価では、純度、HCP、残存DNA、Protein Aリークなどを別々の項目として評価します。

なぜ残存DNAを管理するのか

残存DNAを管理する理由は、製造に使われた宿主細胞由来の核酸が製品中に残ることによるリスクを低く抑えるためです。

特に、連続細胞株無限に増殖できる不死化した細胞株。ゲノムにオンコジーンを含み、残存DNA管理の対象になる。や組換え細胞を使うバイオ医薬品では、宿主細胞由来DNAの残存量を低く管理することが求められます。DNAそのものの量だけでなく、DNAのサイズや由来、製造工程での除去・分解の状況も評価対象になります。残存DNAが管理対象になる主な理由は次の通りです。

理論的に懸念されるリスクには、宿主細胞由来DNAが持つがん遺伝子本来は細胞増殖を促す正常遺伝子だが、活性化するとがん化のきっかけになりうる遺伝子。（オンコジーン）に由来する発がん性と、ウイルス由来配列が含まれる場合の感染性の二つが挙げられます。これらはあくまで理論的リスクであり、精製済みの抗体医薬で問題が顕在化した例が知られているわけではありませんが、 量とサイズの両面で残存DNAを低く抑えることで理論的リスクを下げる という考え方が管理の前提になっています。実際の管理値は、製品の種類、細胞基材、投与経路、投与量、製造工程、リスク評価工程や製品に潜在するリスクの種類・発生可能性・影響度を系統的に特定・分析し、優先的に管理すべき項目を決定する手続き。によって検討されます。

残存DNAの基準値とDNA断片サイズ

残存DNAの管理を理解するうえで欠かせないのが、 残存量とDNA断片サイズという二つの軸 です。

量については、注射剤の宿主細胞由来DNAを 1 投与量あたり 10 ng/dose 以下に抑えるという考え方が、WHOやICH医薬品規制の国際調和を目的として、日米欧の規制当局と製薬業界が参加する国際的なガイドライン策定機関。の議論を背景に長く参照されてきました。これは固定された法定値というより、リスク評価の出発点となる目安であり、実際の規格は製品ごとに設定されます。

サイズについては、DNAの断片が短いほど、生物学的に機能する完全な遺伝子として残るリスクが下がるという考え方があります。一般に 200 bp 程度以下まで断片化していれば理論的リスクは大きく下がるとされ、ヌクレアーゼ処理DNAを分解する酵素で残存DNAを短く切る処理。断片サイズを下げて理論的リスクを減らす。やせん断、ポリッシング捕捉工程の後、電荷や疎水性の違いを使って残った副産物を削り純度を上げる磨き上げ精製。工程での分解・除去によってサイズを小さくすることが管理戦略工程を管理された状態に保つための管理の束。工程条件や試験、規格などを組み合わせて設計する。の一部になります。

ここで注意したいのは、qPCRが測定するのは「特定の標的配列のコピー数」であり、断片サイズそのものは直接は分からない点です。サイズ分布の評価には、ターゲット長の異なるプライマーを設計して比較する、あるいはアガロースゲル電気泳動電気泳動で分離したDNAやタンパク質のゲルを撮影・記録する装置です。バンドの位置や濃さから分子のサイズや量を確認します。詳しく →やキャピラリー電気泳動細い管（キャピラリー）に電圧をかけ、分子の電荷やサイズの違いによる移動速度の差で成分を分離する分析法です。詳しく →を併用するなどの方法が使われます。

残存DNAは工程由来不純物として扱う

残存DNAは、抗体そのものが変化して生じる不純物ではありません。

抗体が会合してできる凝集体、切断されてできる断片、酸化や脱アミド化アスパラギンなどが変化して電荷が変わる化学的分解。特定の隣接配列で起きやすい。によって生じるバリアントは、抗体そのものに由来する製品由来不純物です。一方、残存DNAは、製造に使った宿主細胞から持ち込まれる工程由来不純物です。

この切り分けは、分析法を選ぶうえで重要です。SEC-HPLCで純度を見ても、残存DNA量は分かりません。CE-SDSで断片を確認しても、宿主細胞由来DNAの残存量は分かりません。残存DNAは、 DNAを特異的に検出するqPCRやddPCRなどの核酸分析で評価 します。

工程由来不純物としての性質はHCPとよく似ており、同じ精製工程で同時に低減されることも多くあります。HCPの評価の考え方は HCPとELISA分析の記事 に詳しく整理しています。

qPCRで何を見ているのか

残存DNA分析でよく使われる方法が、qPCR です。

qPCRは、特定のDNA配列をPCRで増幅し、その増幅過程を蛍光シグナルとしてリアルタイムに検出する方法です。残存DNA分析では、CHO細胞、HEK293細胞、E. coliなど、製造に使った宿主細胞に由来するDNAを対象に測定します。標的には、ゲノム中にコピー数が多く保存性の高い反復配列（CHOであればSINEやLINEなどの反復配列）を選ぶことが多く、これにより低濃度でも高感度に検出できます。

qPCRでは、標準DNAを使って検量線を作成し、サンプル中のDNA量を定量します。

qPCRでは、 DNA量が多いほど早いサイクルで蛍光シグナルが立ち上がります 。逆に、DNA量が少ないほど立ち上がりは遅くなります。

抗体医薬の残存DNA分析では、サンプル中のDNAを抽出・精製したうえでqPCRを行います。これは、抗体、塩、界面活性剤、添加剤、バッファ成分などがPCR反応やDNA回収に影響する可能性があるためです。抽出には DNA / RNA抽出 のキットや自動装置が用いられ、低濃度のDNAを再現性よく回収できるかが結果の信頼性を左右します。

qPCRとddPCRは何が違うのか

残存DNA分析では、qPCRに加えて ddPCR（デジタルPCR） が使われることもあります。

qPCRは、標準DNAを用いた検量線に基づいて定量する方法です。一方、ddPCRは、サンプルを多数の微小区画に分け、それぞれの区画でPCR反応を行い、陽性区画と陰性区画の数からポアソン分布に基づいてDNAコピー数を推定します。検量線を介さない絶対定量である点が大きな違いです。

どちらが常に優れているというより、 目的によって使い分けます 。

qPCRは、残存DNA分析の標準的な方法として広く使われています。ddPCRは、低コピー数での確認、検量線に依存しない定量、マトリックス影響の確認などに使われることがあります。とくにマトリックス阻害が疑われる検体では、ddPCRは阻害の影響を受けにくいため、qPCRの結果を裏づける補完手段として有効です。

残存DNA分析で重要な前処理

残存DNA分析では、qPCRそのものだけでなく、 前処理が重要 です。

抗体医薬のサンプルには、高濃度のタンパク質、塩、バッファ、界面活性剤、添加剤などが含まれることがあります。これらはDNA抽出、PCR反応、蛍光検出に影響する可能性があります。そのため、残存DNA分析では、サンプルからDNAを適切に抽出・回収し、PCR阻害を取り除く必要があります。実務では DNA / RNA抽出 の手法を製品マトリックスごとに最適化します。

残存DNA分析では、低濃度のDNAを扱うため、コンタミネーションにも注意が必要です。DNA抽出キット、チューブ、ピペット、試薬、水、作業環境などからの混入を防ぐ必要があります。また、PCRは非常に高感度な分析法であるため、陽性対照、陰性対照、抽出ブランク、スパイクサンプルなどを適切に設定し、測定値の信頼性を確認します。

定量の信頼性を担保するための分析能パラメータとしては、検出限界（LOD）、定量限界（LOQ）、検量線の直線性（決定係数 R^2）、PCR増幅効率（90〜110% 程度が一つの目安）などを評価します。これらは方法バリデーションにおいてあらかじめ設定し、ルーチン試験ではシステム適合性で確認します。

残存DNAはどの工程で減るのか

残存DNAは、抗体医薬の精製工程を通じて低減されます。

細胞培養後のハーベスト液には、宿主細胞由来DNAやHCPなどの不純物が含まれます。清澄化やろ過で細胞や細胞片を除去し、その後のProtein A精製、低pHウイルス不活化、IEX、HIC、MMC、UF / DFなどの工程を通じて、残存DNAをさらに低減します。各工程の位置づけは 抗体の工程フロー で確認できます。

特に AEXやMMCなどのポリッシング工程 は、DNAやHCPなどの工程由来不純物の低減に関係する場合があります。DNAは強い負電荷を持つため、フロースルーモードのAEXや陰イオン交換膜は宿主細胞由来DNAを効率よく捕捉でき、対数除去（LRV）として大きな寄与を示すことが多くあります。

ただし、残存DNAの除去能力は、抗体の性質、工程条件、pH、導電率、樹脂や膜、サンプル中のDNA状態などによって変わります。そのため、工程開発では、各工程前後のサンプルを測定し、どの工程でどれだけDNAが低減されているかを、対数除去率（クリアランス）として定量的に確認します。

DSとDPで残存DNA評価の意味は変わる

残存DNA評価も、 DSとDP で意味が変わります。

DSはDrug Substance、つまり原薬です。DPはDrug Product、つまり製剤です。

DSでは、残存DNA評価は主に精製工程の結果を確認する意味を持ちます。培養由来のDNAが、清澄化、Protein A、ポリッシング、UF / DFなどを通じて十分に低減されているかを見ます。DPでは、残存DNA評価は製剤としての管理値や規格への適合を確認する意味を持ちます。通常、残存DNAは製剤化後に新たに増えるものではありませんが、最終製品としての規格確認や申請資料上の管理項目として重要になります。

DSでは、残存DNAはプロセス由来不純物の低減結果として読みます。DPでは、残存DNAは最終製品としての安全性・規格適合性の確認として読みます。なお、10 ng/dose という目安は最終的に「投与量あたり」で評価する点に注意が必要で、原薬の濃度ベースの値と、製剤の用法・用量を踏まえた1投与あたりの値とを混同しないよう、評価の単位を揃えて読むことが重要です。

同じqPCRの結果でも、工程開発サンプルなのか、原薬なのか、製剤なのかによって意味が変わります。

残存DNAの規格値はどう決まるか

「残存DNAは10 ng/dose 以下」という目安は、細胞に由来する核酸が持つ二つの理論的リスク——発がん性と感染性——を、どちらも十分に低く抑えられる量として逆算された値です。

連続細胞株のゲノムには、活性化するとがん化に関与しうる遺伝子（オンコジーン）が含まれています。もし完全な形のオンコジーンが体内の細胞に取り込まれて発現すれば、理論上は発がんの引き金になりえます。感染性についても同じで、細胞株にウイルス由来配列が組み込まれている場合、機能する配列が残れば感染性のリスクが議論されます。⁠規格値は、この二つのリスクがいずれも無視できる水準になる量として設定される わけです。WHOが1回投与あたり10 ngを目安として示してきた背景には、こうしたリスク評価の積み上げがあります。

ここで効いてくるのが断片長です。オンコジーンにせよウイルス配列にせよ、生物学的に機能するには「ある程度つながった長さ」が要ります。DNAが短く切れているほど、機能する完全な遺伝子として振る舞う確率は下がります。ヌクレアーゼ処理やせん断で〜200 bp 以下まで断片化しておくことは、量を減らすのと同じくらい意味を持ちます。⁠同じ10 ngでも、長い断片として残るか短い断片として残るかで、実質的なリスクは大きく変わります 。近年は、量そのものより「機能しうる長さの配列がどれだけ残るか」を重視する議論も進んでいます。

そして忘れてはいけないのが、細胞株による差です。10 ngはあくまで出発点であり、腫瘍原性（tumorigenicity）や造腫瘍性の高い細胞基材を使う場合は、より厳しく管理すべきという判断になります。逆に、これらのリスクが低いと評価される細胞基材では、リスクベースで管理値が検討されます。つまり規格は「どの細胞を使い、どんな断片長で、どの経路からどれだけ入るか」を掛け合わせて、製品ごとに決まります。10 ngという数字は、その計算の共通の物差しにあたります。

なお、細胞株そのものを治療に用いる遺伝子・細胞治療では、残存DNAの意味合いや規格の立て方が抗体医薬とは異なります。この違いは 遺伝子治療の品質管理 の考え方とあわせて読むと整理しやすくなります。

まとめ

残存DNAとは、抗体医薬の製造に使われる宿主細胞に由来し、原薬や製剤中に微量に残るDNAのことです。凝集体や断片のような製品由来不純物ではなく、HCPやProtein Aリークと同じ工程由来不純物として扱います。

管理では「量（10 ng/dose 程度以下）」と「断片サイズ（200 bp 程度以下）」の二軸を押さえ、主に qPCR や ddPCR で宿主細胞由来DNAを高感度に定量します。測定では、DNA抽出、PCR阻害、標準DNA、検量線、スパイク回収、LOD / LOQ、コンタミネーション管理が結果の信頼性を左右します。

残存DNAは、ハーベスト、清澄化、Protein A、ポリッシング、UF / DFなどの工程を通じて低減され、とくにAEXやMMCが負電荷を持つDNAの除去に寄与します。工程開発では、各工程前後のサンプルを測定し、対数除去率として低減を確認します。DSでは精製工程の低減結果を、DPでは最終製品としての規格適合性を読み取ります。

残存DNAを理解することは、qPCRの原理を知るだけでなく、 細胞基材、精製工程、工程由来不純物管理、規格設定をつなげて読む ことでもあります。

参考文献

• USP <509>: Residual DNA Testing.
• USP General Chapter on Nucleic Acid-Based Techniques（qPCR / dPCR）.
• ICH Q5A(R2): Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin.
• ICH Q5D: Derivation and Characterisation of Cell Substrates Used for Production of Biotechnological / Biological Products.
• ICH Q6B: Specifications — Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological / Biological Products.
• WHO Technical Report Series: Recommendations for the evaluation of animal cell cultures as substrates for the manufacture of biological medicinal products（continuous cell line由来DNAの考え方）.
• FDA: Guidance for Industry — Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines.
• Yang H. Establishing acceptable limits of residual DNA. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 2013.
• Higashiyama K, et al. Quantitation of Residual Host Cell DNA in Recombinant Therapeutic Proteins by Droplet Digital PCR. 2023.