細胞株開発とは？力価のいちばん高いクローンを選べばよいのか

細胞株開発とは、抗体医薬を作る細胞を、数千の候補から製造に使う1株に決める工程です。開発の研究者だけでなく、品質保証の担当者や受託先を選ぶ担当者にとっても、何年も続く製造の出発点を決める仕事にあたります。

ただし、⁠プレートでいちばん多く抗体を作ったクローンが、そのまま製造株になるとは限りません。 培養槽に移したときや継代増殖した細胞を定期的に希釈・移植して培養を維持する操作で、回数が増えると細胞の性質が変化するリスクがある。詳しく →を重ねたあとに、増殖や品質が崩れる株があるからです。

この記事では、細胞株開発で何が決まるのか、力価だけで選ばない理由、何を基準に1株に絞るのか、単一細胞由来をどう示すのか、自分の場合は何から確かめるのかを順に説明します。

1. 細胞株開発とは、何を決める工程なのか

細胞株開発（cell line development）とは、宿主の細胞に抗体の遺伝子を入れ、安定して作り続ける単一細胞由来のクローンを1株選ぶ工程です。 宿主には、CHO細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞抗体など組換えタンパク質の生産に広く使われる、チャイニーズハムスター卵巣由来の培養細胞です。詳しく →）が主に使われます（CHO細胞とは）。

1個の細胞から増やした集団をクローンと呼び、これを数百から数千つくって1株を選びます。工程は次の6段で進みます。

• 宿主と選択系を決める⁠：使う細胞と、遺伝子を取り込んだ細胞の選び方を決めます。
• ベクターを組む⁠：抗体のH鎖とL鎖の遺伝子を、細胞へ運ぶDNA（ベクター）に載せます。
• 遺伝子を入れて選ぶ⁠：細胞に遺伝子を入れ、取り込んだ細胞だけを生き残らせます。
• 1個ずつに分ける⁠：細胞を1個ずつウェルに分け、そこから増やします。
• クローンを比べる⁠：力価（培養液中の抗体の濃度）、増殖、代謝、品質で候補を絞ります。
• 継代で確かめて凍結する⁠：継代を重ねても崩れない1株を、マスターセルバンク製造の起点となる細胞を段階的に均質に凍結保存した在庫（マスター/ワーキングセルバンク）。詳しく →（MCB）として凍結します。

図をダウンロード（会員・無料）

選んだ株はセルバンクとして凍結され、シードトレインから本培養種培養で増やした細胞を大型の培養槽に移し、目的物質を本格的に産生させる最終段階の培養です。栄養を追加しながら育てるフェドバッチが広く使われます。詳しく →、精製まで使われます。後から別の株に替えると、品質が同等であることを比べて示す試験が要ります。

ICH Q5D生物薬品の製造に使う細胞基材の樹立と特性解析について定めた国際調和ガイドライン。詳しく →（細胞基材の由来と特性解析の指針）は、細胞の由来や履歴が製品の品質と安全性に影響し得るという考え方に立っています。遺伝子を入れた方法やクローンを取った履歴の記録は、審査でも技術移転でも問われます。

つまり、細胞株開発で選ぶ1株は、何年も続く製造で取り替えにくい出発点です。

2. なぜ、力価のいちばん高いクローンを選べばよいとは限らないのか

プレートでは見えにくい弱さが、培養槽や長い継代で初めて表に出るからです。 96ウェルプレートで首位だった株が、培養槽では伸びなかったり、継代のうちに抗体の量が落ちたりして、製造株になれないことがあります。

培養槽に移すと見えてくる弱さ

力価だけで上位を決めると、あとで次のようなことが起きます。

• 増殖⁠：培養槽に移すと、細胞の立ち上がりが遅れます。
• 代謝⁠：培養の後半に乳酸やアンモニアグルタミンの代謝と化学分解で生じる代謝副産物。蓄積すると増殖・生存を落とし、糖鎖の質にも影響する。詳しく →がたまり、生存率細胞集団のうち生きている細胞の割合。凍結・培養の品質を示す基本指標。詳しく →が落ちます。
• 品質⁠：凝集体が増えて精製の収率が下がります。

力価を上げる方法が生む不安定さ

もう一つの理由は、力価を上げる手段そのものが不安定さを生むことです。遺伝子を取り込んだ細胞だけを生き残らせる仕組みを選択系と呼びます。代表は、グルタミン合成酵素（GS）を阻害剤のメチオニンスルホキシミン（MSX）で抑えるGS/MSX系と、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）を阻害剤のメトトレキサート（MTX）で抑えるDHFR/MTX系DHFR欠損CHOを使い、メトトレキサートで段階的に遺伝子増幅を行って高発現株を選ぶ古典的な選抜方式。詳しく →です。

DHFR/MTX系は、阻害剤の濃度を段階的に上げて遺伝子を増やす古典的な方式です。高発現の株を得やすい反面、選抜を重ねるので期間が長くなり、増えた領域が不安定になることもあります。GS/MSX系では、GSを欠いたCHO細胞を使えば、阻害剤なしか低い濃度でも選べ、開発期間が短くなる場合があります。

選択の圧を強くすれば良い株が取れる、とは限りません。阻害剤の濃度を上げても産生が比例して上がるとは限らず、乳酸やアンモニアが増えるクローンも出ます。遺伝子がゲノムのどこに入るかでも、産生はクローンごとにばらつきます。高発現が確かめられた場所へ狙って入れる部位特異的組込み（targeted integration）は、このばらつきを減らして期間を縮めるねらいで採用が広がっています。

このように、プレートの力価は候補を絞る最初の物差しにすぎず、製造株として崩れないかは別の物差しで確かめる必要があります。

3. では、何を基準に1株に絞るのか

力価に加えて増殖・代謝・品質で候補を減らし、残った数株を頑健性と継代安定性継代を重ねても生産性や品質を保てるかという性質。培養条件変動への耐性（robustness）とは分けて評価する。詳しく →で比べて1株に絞ります。

初期の力価は、酵素免疫測定法（ELISA）やバイオレイヤー干渉法センサー先端に結合した分子の膜厚変化を光の干渉で捉え、抗体などの結合・解離のしやすさ（親和性）をリアルタイムで測る手法です。詳しく →（BLI）、Protein A を使う高速液体クロマトグラフィー固定相と移動相の間での物質の相互作用（分配・吸着・イオン交換など）の差を利用して、混合物中の成分を分離・精製する操作の総称。詳しく →（HPLC）で培養上清を測ります（力価・濃度分析）。同じ段階で、立ち上がりが遅い株、乳酸がたまって pH を保ちにくい株、凝集体や断片が目立つ株を外します。

品質を早く見るのは、培養上清の時点で凝集や断片化主鎖が切れて分子が分かれる劣化。低分子量体（LMW）として現れ、酸性側などで進みやすい。詳しく →が強い株は、精製の後半で苦労し、収率も落ちるからです。凝集体分析、電荷バリアント分析、糖鎖分析は、この段階で当てておきます。

残った数株では、「安定性」という言葉に混ざっている2つの意味を分けて確かめます。

• 頑健性（robustness）：接種密度、フィード、pH、溶存酸素培養液に溶けている酸素の濃度。細胞の呼吸を支えるため一定に保つ制御対象。詳しく →、温度が少しずれても、増殖と品質が乱れないかを見ます。ミニバイオリアクターなどで、槽に近い条件をつくって確かめます。
• 継代安定性（production stability）：継代を重ねても、産生量と品質が保たれるかを見ます。

図をダウンロード（会員・無料）

継代安定性について、ICH Q5D は、少ない継代数の細胞と、申請する継代数（in vitro cell age細胞が継代を重ねて進む培養上の年齢。製造に許容する上限を設計で管理する。詳しく →）の上限かそれを超えた細胞とを比べるよう示しています。比べるのは産生量だけではありません。入れた遺伝子とその周りの配列（発現コンストラクト。解析は ICH医薬品規制の国際調和を目的として、日米欧の規制当局と製薬業界が参加する国際的なガイドライン策定機関。詳しく → Q5B が扱います）、増殖、グルコースの消費、乳酸とアンモニアの産生も確かめます。

プレートで高力価だった株が製造株になれないときは、この2つのどちらかで引っかかっていることが少なくありません。条件の揺れに弱いのか、継代で産生が落ちるのかで、打つ手は変わります。

つまり、候補を比べる表には、力価の列だけでなく、条件をずらした結果と、継代の前後を比べた結果の列が要ります。

4. 単一細胞由来であることは、どう示すのか

細胞を1個ずつに分けた時点で残した画像と記録で示します。 混ざった集団だと、産生の高い細胞と低い細胞の比率が時間とともに動き、ロットごとの品質が揺れやすくなります。当局がクローン性を重く見るのはこのためです。

従来の限界希釈法細胞を統計的に1ウェル1個になる濃度で播種し、単一細胞由来のクローンを得る古典的な手法。は、1ウェルあたり平均1個に満たない薄さで播くことを繰り返し、確率を高めます。確率の話なので、1回では言い切れません。近年は、セルソーターやシングルセル分注装置で細胞を1個ずつ分け、播いた直後（Day 0）の画像とその後の増殖を撮像で残す流れが強まっています。

見分けのつく2種類のCHO細胞を混ぜて播いた実験では、撮像を組み合わせた1回のクローニングで、99%を超えるモノクローナリティ産生細胞株が単一の細胞に由来していること。単クローン性。詳しく →の確率が報告されています（論文の解説）。当局が見るのは装置の名前ではなく、どの記録に基づいて単一細胞由来と判断したのかです。

単一細胞から取った株でも、均一さが後から崩れることはあります。Scarcelli らの2018年の報告では、IgG2抗体の細胞株で原薬原薬。精製を終えた有効成分そのもので、製剤化する前の段階を指す。詳しく →から配列の変異体が見つかり、単一細胞から樹立したはずのマスターセルバンクが、変異体を持つ細胞と持たない細胞の混ざりだったと考えられました。同じ報告では、混ざりがあっても、継代を通して工程の再現性と品質は保たれていました。

このように、単一細胞由来を説明できるかどうかは、クローニングの前に記録の残し方を決めたかどうかで決まります。

参考文献

• ICH Q5D, Derivation and Characterisation of Cell Substrates Used for Production of Biotechnological/Biological Products.
• ICH Q5B, Quality of Biotechnological Products: Analysis of the Expression Construct in Cells Used for Production of r-DNA Derived Protein Products.
• Noh SM et al., Comprehensive characterization of glutamine synthetase-mediated selection for the establishment of recombinant CHO cells producing monoclonal antibodies, Scientific Reports, 2018.
• Fan L et al., Improving the efficiency of CHO cell line generation using glutamine synthetase gene knockout cells, Biotechnology and Bioengineering, 2012.
• Scarcelli JJ et al., Analytical subcloning of a clonal cell line demonstrates cellular heterogeneity that does not impact process consistency or robustness. Biotechnology Progress. 2018;34(3):602-612.（IgG2抗体の細胞株で見つかった配列変異体とマスターセルバンクの混ざり）