低pHウイルス不活化とは？酸に置く条件の幅が狭いのはなぜか

低pHウイルス不活化は、抗体医薬の精製で、Protein A抗体に特異的に結合するProtein Aを担体に固定し、抗体だけを選択的に捕まえて精製する手法です。抗体医薬の最初の精製工程として定番になっています。詳しく → から外した酸性の液をそのまま決めた時間置き、混ざっているかもしれないウイルスの感染力を失わせる工程です。精製の担当者はその pH と時間を決め、品質保証や申請の担当者は、その条件でウイルスが減ることを試験の報告書で確かめます。

一方で、酸が効くのは脂質の膜を持つウイルスに限られ、酸に置きすぎると抗体のほうが固まり始めます。

規制の例として示された「pH 3.6 以下・30分以上」が自社の条件に使えるかどうか、報告書のどこを見れば効いたと言えるのかが、読み終えたときに判断できるようにまとめました。

1. 低pHウイルス不活化は、Protein Aの溶出液で何をしているのか

Protein A の溶出液を目標の pH まで下げ、決めた時間置いてから中和する、それだけの工程です。 フィルターのようにウイルスを取り除くわけではありません。粒子は液に残ったまま、細胞に感染できない状態に変わります。

Protein A は、抗体に結合するタンパク質をレジンに付けたクロマトグラフィー固定相と移動相の間での物質の相互作用（分配・吸着・イオン交換など）の差を利用して、混合物中の成分を分離・精製する操作の総称。詳しく →で、精製の最初に培養液から抗体を捕まえます（Protein A）。抗体をレジンクロマトグラフィーで目的物や不純物を結合させる粒子状の充填材。精製モードごとに使い分ける。詳しく →から外すときに酸性の緩衝液溶液のpHを一定範囲に保つために使用される弱酸と共役塩基の混合溶液。詳しく →を流すので、出てくる液はもともと酸性です。少し酸を足して目標の pH に合わせれば、そのまま置くだけで済みます。

ICH Q5A(R2)細胞株由来のバイオ医薬品について、ウイルス安全性評価の枠組みを示すICHガイドライン。詳しく → も、捕捉クロマトグラフィーの溶出液を低pHで置く処理が、抗体などの製造でレトロウイルスの不活化ウイルスの感染性を失わせること。低pH保持や溶媒/界面活性剤処理で、エンベロープウイルスに効きやすい。詳しく →に広く使われてきたと書いています。保持のあとはアルカリで pH を戻し、そのとき出る濁りはろ過で除きます（中和と析出物のろ過）。

図をダウンロード（会員・無料）

この工程で品質の側が決めるのは装置ではなく、pH・時間・温度と、液の組成です。では、酸を当てると何がウイルスに起きるのでしょうか。

2. 酸で感染力を失うのは、膜を持つウイルスだけ

酸が効くのは、脂質の膜（エンベロープ一部のウイルスが持つ脂質の外膜。レンチウイルスではVSV-Gなどをまとうが、温度・剪断・凍結融解に弱い。詳しく →）をまとったウイルスです。 膜には、細胞に取り付いて入り込むためのタンパク質が刺さっていて、酸性の液ではこのタンパク質の形が崩れます。ICH医薬品規制の国際調和を目的として、日米欧の規制当局と製薬業界が参加する国際的なガイドライン策定機関。詳しく → Q5A(R2) は、これで細胞への吸着と感染が妨げられると説明しています。

抗体を作るチャイニーズハムスター卵巣細胞抗体など組換えタンパク質の生産に広く使われる、チャイニーズハムスター卵巣由来の培養細胞です。詳しく →（CHO 細胞）など、げっ歯類から得た細胞には、レトロウイルスに似た粒子を持つものがあります。ICH Q5A(R2) は、こうした細胞の製品では、工程がげっ歯類のレトロウイルスを除く・不活化する力を確かめるべきとし、その方法としてマウス白血病ウイルスをモデルに使えるとしています。レトロウイルスは膜を持つので、低pH処理がちょうど当てはまります。

では、膜を持たないウイルスは？　ICH Q5A(R2) の付表では、パルボウイルスエンベロープを持たない極めて頑健な小型ウイルス。化学処理に強く、除去はサイズ排除のろ過が有効。詳しく →は物理化学的な処理への抵抗性が「非常に高い」に分けられています。そこで、大きさで止めるウイルスろ過を後ろに重ねます。ICH Q5A(R2) も、仕組みの違う2つの工程を置き、その1つは膜のないウイルスに効くものにするよう勧めています（製品に悪影響がなく、実施できる場合）。

低pH処理は、ウイルス対策の一部を受け持つ工程です。その一部を確実に果たすには、どの pH にどれだけ置くかを決めなければなりません。

3. pHと時間は、なぜ広く取れないのか

pH を下げるほど、置く時間を延ばすほどウイルスは壊れやすくなりますが、同じ向きに抗体も凝集しやすくなるからです。 凝集体タンパク質分子どうしが結合してできた高分子量の集合体です。有効性や免疫原性に影響するため、その含量を測ります。詳しく →（抗体が固まってできた塊）は不純物として除く必要があり、増えれば収率と品質の両方に響きます。

抗体の側の例として、ある IgG4 を Protein A の溶出液に置いた実験では、時間とともに単量体が減り、その減る速さは pH によって変わりました。同じ抗体を Protein A を通さずに低pHへ置いた場合より、Protein A を通したあとのほうが速く減ったと報告されています（Mazzer ら、2015）。1種類の抗体での結果ですが、緩衝液だけで測った安定性が、実際の溶出液の挙動と一致しない場合があることを示しています。

図をダウンロード（会員・無料）

⁠ウイルスが十分に減り、凝集体も増えすぎない条件は、図のような細い帯としてしか残りません。 帯の位置は、抗体と溶出液ごとに測って決めます。ウイルスの側には規制の例があり、抗体の側には無いためです。

4. ICH Q5A(R2)の「pH 3.6以下・15 °C以上・30分以上」は何を意味するのか

塩化ナトリウム 500 mmol/L 以下の液で、この条件ならモデルのレトロウイルス（XMLV）を効果的に不活化できる、という現時点の理解を示した例です。 ICH Q5A(R2) の付属書5に書かれており、酢酸とクエン酸の緩衝液がよく使われ、安定して不活化できるとも添えています。

同じ表で、不活化を大きく左右する条件として挙がっているのは pH、時間、温度、緩衝液の組成です。一方、製品の濃度や種類（抗体、半分子抗体、二重特異性抗体2つの異なる標的に同時に結合する抗体。T細胞と標的細胞を橋渡しする用途などがある。詳しく →、融合タンパク質など）は、示された条件の範囲では影響が見られなかったとされています。ウイルスの側から見れば、抗体が変わっても効き方は変わりにくい、ということです。

ここから、社内の別の製品で得たデータを新しい製品に使う「プラットフォーム」の考え方が、低pHの XMLV 不活化には適用できると書かれています。ただし付属書5は、これらの例は説明のためのもので、雛形や申請の唯一の根拠として使うべきではないと断っています。本文 6.6 も、工程と中間体の液が似ていることを示す必要があり、裏づけが足りなければ製品ごとの試験を行うべきとしています。

5. 試験報告書では、最短時間より前の時点と条件の端を確かめる

不活化の効きは、縮小した工程にモデルウイルスを加え、時間を追って感染力を測った結果で確かめます。 報告書では、次の4点を見ます。

• 時間の取り方⁠：ICH Q5A(R2) 6.2.5 は、不活化は単純な一次反応ではなく、はじめに速く、あとでゆっくり進むことが多いとし、複数の時点で試料を取って不活化の曲線を描くよう求めています。さらに、決めた最短の保持時間に加え、それより短い（0 より大きい）時点を1つ以上含めることを推奨しています。
• 再現⁠：効果のある工程の目安は、4 log10（1万分の1）以上の減少を、少なくとも2回の独立した試験で再現よく示すことです（6.3）。1〜3 log10 の工程も、全体の評価に入れることができます。
• 条件の端⁠：スケールダウンモデルでは、関係する条件を不利な側（worst case）にして試すことが望ましい場合がある、とされています（6.2.2）。低pHなら、許容範囲の pH の高い側、時間の短い側、温度の低い側です。
• スケールダウンモデルの再現性⁠：酸の加え方、混ぜ方、pH の測り方が実機と違えば、数字は実機の力を表しません。

不活化が速すぎて曲線が描けないときは、不活化剤を弱めた試料などの対照で、感染力が本当に不活化で失われたことを示すよう書かれています。⁠報告書の「4 log 以上」は、どの条件の端で、どのモデルウイルスで、何点の時間で測った値かと一緒に読んで初めて、自社の工程の力として扱えます。

合計への入れ方にも注意が要ります。工程ごとの対数減少値（LRV）工程の前後で不純物やウイルスが何桁減ったかを対数で表す指標。除去能を定量的に示す。詳しく →を足して合計を出すとき、膜のないウイルスについては、低pH処理の行は入れません（LRVは工程ごとに足していい？）。報告書全体の読み方はウイルスクリアランスで扱います。

6. 連続生産では、最も速く抜ける液が基準

液が流れ続ける連続生産では、すべての液に決めた保持時間を経験させたことを示す必要があります。 バッチならタンクの液全体を同じ時間置けますが、管の中を流すと、同じ時に入った液でも出口に着く時間がばらつきます。このばらつきを滞留時間分布各工程に物質が留まる時間のばらつきで、連続生産では最終品質を左右する。詳しく →と呼びます。

ICH Q5A(R2) 7.3.2 は、連続の工程での不活化について、pH、均一さと混ざり方、温度、滞留時間分布などの動的な条件の管理を確保するよう求めています。スケールダウンモデルを使うときは、規模で滞留時間分布や管理の方法が変わる影響を慎重に評価するよう書かれています。

品質の側では、最も速く抜ける液でも保持時間を満たす設計になっているか、分布を実測した結果があるかを確かめます。

7. 自社の工程では、抗体の凝集データから確かめる

最初に見るのは、自社の抗体で pH と時間を振ったときの凝集体の増え方です。 これが決まらないと、許容範囲もウイルス試験の条件の端も決まりません。

• 抗体の凝集データ⁠：実際の Protein A 溶出液で pH と時間を振り、中和後の凝集体（サイズ排除クロマトグラフィー多孔質の担体を通る時間差で分子をサイズ順に分離し、抗体の凝集体や断片がどれくらい含まれるかを測る手法です。詳しく →などで測る）の増え方を見ます。
• 許容範囲と規制の例⁠：pH・時間・温度・塩濃度の範囲が、ICH Q5A(R2) 付属書5の例の内か外かを確かめます。外なら、その条件での試験を計画します。
• ウイルス試験の報告書⁠：条件の端で試したか、最短時間より前の時点があるか、2回の独立した試験か、スケールダウンモデルが実機の酸の加え方と混ぜ方を再現しているかを見ます。
• 運転の手順⁠：保持時間を数え始める時点、pH 計の校正、範囲を外れたときの扱い（再処理か廃棄か）を手順書作業の手順を定めた文書。品質システムの要素を具体化し、査察でも運用が確認される。詳しく →に定めます。
• 後ろの工程とのつながり⁠：膜のないウイルスへの備えはウイルスろ過で、合計の数え方は対数減少値（LRV）の行ごとに確かめます。

受託先に確かめるときは、「低pH保持の許容範囲と、その端でのウイルス試験の結果」を一緒に出してもらうと、上の「許容範囲と規制の例」と「ウイルス試験の報告書」を一度に見られます。

参考文献

• ICH Q5A(R2) Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin（6.1.1 マウス白血病ウイルスをモデルとすること、6.2.2 スケールダウンモデルと不利な側の条件、6.2.5 不活化の曲線と最短の保持時間より前の時点、6.3 4 log10 以上を2回の独立した試験で示す目安と仕組みの違う2工程、6.6 先行知見の使い方、7.3.2 連続生産での不活化、付表 Annex 1無菌医薬品の製造に関するEU GMPの付属書。汚染管理戦略などを求める無菌製造の基準。詳しく → のウイルスの抵抗性、Annex 5 5.1・5.3 低pH不活化の仕組みと条件の例）
• Mazzer AR, Perraud X, Halley J, O'Hara J, Bracewell DG. Protein A chromatography increases monoclonal antibody aggregation rate during subsequent low pH virus inactivation hold. J Chromatogr A. 2015;1415:83-90.