細胞株開発・クローン選抜
細胞株の遺伝学的評価、導入配列、変異確認の前処理に使われる。
主な用途
- 遺伝学的評価
Product Guide
ライブラリー調製・前処理
ライブラリー調製・前処理は、NGS解析に使用するDNAやRNAサンプルを、シーケンサーで読み取れる形に変換する工程です。断片化、末端修復、アダプター付加、インデックス付加、PCR増幅、ターゲット濃縮、精製、定量、品質確認などを行い、「シーケンスライブラリー」と呼ばれる状態に整えます。ライブラリー調製の品質は、NGSデータの品質に大きく影響します。
用途・特徴
ライブラリー調製・前処理は、DNA/RNAサンプルをNGSに適した形へ変換するために使われます。主な処理には、核酸抽出後の品質確認、DNA断片化、RNA逆転写、アダプター付加、インデックス付加、PCR増幅、ターゲット濃縮、ビーズ精製、ライブラリー定量、サイズ確認があります。
解析目的によって、全ゲノムシーケンス、ターゲットシーケンス、RNA-seq、アンプリコンシーケンス、メタゲノム解析、外来性ウイルス検出、ロングリードシーケンスなど、必要な前処理が異なります。
Point
- DNA/RNAをNGSで読めるライブラリーに変換する工程
- 断片化、アダプター付加、インデックス付加、PCR増幅、精製が関係する
- NGSデータ品質に大きく影響する
- 全ゲノム、ターゲット、RNA-seq、メタゲノム、外来性ウイルス検出で使われる
- ライブラリー濃度、断片サイズ、アダプターダイマーの確認が重要
- 自動化装置やリキッドハンドラーと組み合わせることが多い
- GMPや品質試験では、手順標準化、コンタミ防止、記録管理が重要になる
使用方法
基本的には、抽出したDNA/RNAの品質を確認し、解析目的に応じたライブラリー調製キットで前処理を行います。
1DNAまたはRNAを抽出する
2核酸濃度と品質を確認する
3必要に応じてDNAを断片化する
4末端修復・A-tailingを行う
5アダプターを付加する
6インデックスを付加する
7PCR増幅またはターゲット濃縮を行う
8ビーズ精製で不要物を除去する
9ライブラリー濃度・サイズ分布を確認する
10シーケンサーにロードする
実際の条件は、サンプル種、入力量、解析方式、リード長、シーケンサー、キット、ターゲット濃縮の有無、自動化の有無、GMP対応によって変わります。
DNA/RNA抽出との違いは？
DNA/RNA抽出とライブラリー調製は連続した工程ですが、目的が異なります。
結論
DNA/RNA抽出は「核酸を取り出す工程」、ライブラリー調製は「NGSで読める形に加工する工程」と考えるとわかりやすくなります。
主な目的
サンプルから核酸を取り出す
核酸をNGSで読める形にする
主な対象
細胞、組織、血液、培養上清、工程液
抽出済みDNA/RNA
主な処理
溶解、結合、洗浄、溶出
断片化、アダプター付加、インデックス付加、増幅
後続工程
PCR、dPCR、NGS、Sanger
NGSシーケンス
品質確認
濃度、純度、分解状態
ライブラリーサイズ、濃度、アダプターダイマー
使う装置
DNA/RNA抽出装置
自動分注装置、断片化装置、PCR装置、QC装置
PCR・Sanger前処理との違いは？
| 項目 | PCR/Sanger前処理 | NGSライブラリー調製 |
|---|---|---|
| 主な対象 | 特定領域、PCR産物、プラスミド | 多数のDNA/RNA断片 |
| 主な目的 | 狙った配列を増幅・確認する | 多数断片を並列に読める状態にする |
| アダプター | 基本的には不要 | 必要 |
| インデックス | 基本的には不要 | 多サンプル同時解析で必要 |
| QC | PCR産物確認、濃度確認 | サイズ分布、濃度、アダプターダイマー確認 |
| 解析規模 | 小さい | 大きい |
主なライブラリー調製方式
| 方式 | 内容 | 向く用途 |
|---|---|---|
| DNAライブラリー調製 | DNAを断片化し、アダプターを付加する | 全ゲノム、ターゲット解析、メタゲノム |
| RNA-seqライブラリー調製 | RNAをcDNA化し、ライブラリー化する | 遺伝子発現、細胞状態解析 |
| アンプリコンライブラリー調製 | PCR産物にアダプターやインデックスを付ける | 遺伝子編集確認、微生物解析、ターゲット解析 |
| ターゲット濃縮 | 特定領域をキャプチャまたはPCRで濃縮する | 変異解析、外来性ウイルス、遺伝子パネル |
| メタゲノムライブラリー調製 | サンプル中の核酸を広くライブラリー化する | 汚染確認、微生物・ウイルス検出 |
| ロングリードライブラリー調製 | 長いDNA/RNAを保持してライブラリー化する | プラスミド全長、AAV構造、構造変異 |
| シングルセルライブラリー調製 | 単一細胞単位でバーコード化する | 細胞治療、免疫解析、細胞集団解析 |
| 外来性ウイルス検出用ライブラリー | ウイルスや微生物核酸を検出しやすい形にする | セルバンク、未精製バルク、細胞治療 |
主な前処理ステップ
| ステップ | 内容 | 注意点 |
|---|---|---|
| 核酸抽出 | DNA/RNAをサンプルから取り出す | 阻害物質、分解、回収率 |
| 核酸定量 | 入力量を確認する | Qubit、NanoDrop、qPCRなど |
| 断片化 | DNAを適切なサイズに切断する | 断片サイズ、過断片化 |
| 末端修復 | DNA断片末端をライゲーション可能にする | 反応効率、酵素条件 |
| アダプター付加 | シーケンサー用アダプターを付ける | アダプターダイマー |
| インデックス付加 | サンプル識別用バーコードを付ける | インデックスホッピング、取り違え |
| PCR増幅 | ライブラリー量を増やす | PCRバイアス、重複率 |
| ターゲット濃縮 | 目的領域を選択的に濃縮する | カバレッジ均一性 |
| ビーズ精製 | 不要物や短い断片を除去する | ビーズ比、回収率 |
| サイズ確認 | ライブラリー分布を確認する | アダプターダイマー、目的サイズ |
| ライブラリー定量 | シーケンス投入量を決める | qPCR、蛍光定量、電気泳動 |
選定ポイント
解析目的WGS、RNA-seq、ターゲット、外来性ウイルス、AAV解析など
入力核酸DNA、RNA、低入力、分解サンプル、ウイルス核酸に対応するか
サンプル数手作業でよいか、自動化が必要か
シーケンサーIllumina、Ion Torrent、Nanopore、PacBioなどに適合するか
ライブラリー方式PCRベース、ライゲーションベース、タグメンテーションなど
ターゲット濃縮アンプリコン型か、ハイブリッドキャプチャ型か
インデックス必要なサンプル数、デュアルインデックス対応の有無
QC方法Qubit、TapeStation、Bioanalyzer、Fragment Analyzerに対応するか
自動化リキッドハンドラー、抽出装置、PCR装置と連携できるか
GMP対応手順固定、記録、監査証跡、試薬ロット管理が可能か
コストキット、チップ、ビーズ、ランニングコスト
受託利用自社調製か、外部受託解析か
使用される工程
ライブラリー調製・前処理は、NGS解析が関係する多くの工程で使われます。
遺伝子導入・安定発現株作製
挿入配列、コピー数、ゲノム挿入部位解析に関係する。
主な用途
- 挿入部位解析
セルバンク
外来性ウイルス検出、細胞同一性、遺伝学的安定性評価の前処理に使われる。
主な用途
- 外来性検出
汚染確認・安全性評価
ウイルス、微生物、マイコプラズマ、外来性因子検出に使われる。
主な用途
- 汚染確認
本培養
未精製バルクや工程液の外来性因子・核酸解析に関係する。
主な用途
- 工程液解析
ハーベスト・清澄化
未精製バルク試験や工程中間体解析で使われる。
主な用途
- 中間体解析
品質評価・分析
NGSベースの品質確認、変異解析、配列確認に使われる。
主な用途
- 配列確認
AAV製造
ベクターゲノム、プラスミド、外来性因子解析に使われる。
主な用途
- ベクター解析
mRNA-LNP製造
プラスミド鋳型、Linear DNA、RNA関連解析に使われる。
主な用途
- 鋳型解析
細胞治療製造
遺伝子導入、オフターゲット、細胞状態解析に関係する。
主な用途
- オフターゲット
遺伝子編集
編集効率、オフターゲット解析、クローン確認に使われる。
主な用途
- 編集確認
GMP品質管理
NGSを規格試験や確認試験に使う場合に関係する。
主な用途
- 規格試験
使用されるモダリティー
ライブラリー調製・前処理は、核酸解析や安全性評価が関係する多くのモダリティーで使われます。
抗体医薬
関連度中〜高
CHO細胞セルバンク外来性ウイルス検出
細胞株特性解析やウイルス安全性評価に関係する。
ADC
関連度中〜高
抗体原薬用CHO細胞セルバンク
抗体部分の製造細胞株評価で関係する。
二重特異性抗体
関連度中〜高
CHO細胞細胞株開発
抗体医薬と同様に使われる。
Fc融合タンパク質・組換えタンパク質
関連度中〜高
産生細胞セルバンク品質評価
製造細胞や外来性因子評価に使われる。
AAV
関連度高
ベクター構造外来性因子残存核酸
AAV品質評価や工程理解で重要。
レンチウイルス
関連度高
ベクター構造RCL関連Producer Cell
遺伝子治療・細胞治療ベクターの評価に関係する。
プラスミドDNA
関連度高
プラスミド全長配列変異確認原材料確認
mRNAやAAV原料の配列確認に使われる。
mRNA-LNP
関連度高
プラスミド鋳型Linear DNARNA品質
原材料・鋳型DNA・RNA関連解析に使われる。
細胞治療
関連度高
CAR-TT細胞NK細胞・MSC
導入配列、細胞状態、外来性因子、オフターゲット評価に関係する。
iPS細胞・幹細胞由来製品
関連度高
iPS細胞分化細胞マスターセル
遺伝学的安定性、変異、細胞同一性評価で使われる。
遺伝子編集
関連度高
CRISPR編集細胞オフターゲット解析
編集効率、挿入欠失、オフターゲット解析に使われる。
ワクチン
関連度高
細胞基材ウイルスシード原液
外来性ウイルス、ウイルス配列、品質確認に使われる。
微生物発酵
関連度中〜高
菌株確認ゲノム解析発酵微生物
菌株特性や汚染確認に使われる。
低分子医薬品
関連度低〜中
細胞アッセイ微生物評価毒性評価
製造工程よりも評価系や微生物解析で使われる。
メーカー製品
NGSライブラリー調製キット（14）
IlluminaIllumina DNA PrepDNAライブラリー調製キット。多様なゲノム解析に使われ、Illuminaシーケンサー向けに最適化されている。公式URL IlluminaNextera XT DNA Library Preparation Kit小ゲノム、PCRアンプリコン、プラスミド、cDNAなどのライブラリー調製に使われるキット。短時間ワークフローと低入力量が特徴。公式URL IlluminaIllumina RNA PrepRNA-seq用ライブラリー調製キット。遺伝子発現やトランスクリプトーム解析に使われる。公式URL IlluminaIllumina Stranded mRNA PrepmRNA-seq用のライブラリー調製キット。遺伝子発現解析や細胞状態評価に使われる。公式URL Thermo Fisher Scientific / Ion TorrentIon AmpliSeq Library Kit 2.0Ion AmpliSeqパネルを用いたアンプリコンライブラリーを迅速に調製するキット。ターゲットシーケンスに使われる。公式URL Thermo Fisher Scientific / Ion TorrentIon AmpliSeq HD Library KitIon AmpliSeq HD技術を用いたアンプリコンベースのライブラリー調製キット。低頻度変異や高感度解析で使われる。公式URL Oxford Nanopore TechnologiesLigation Sequencing Kitナノポアシーケンス用のライゲーションベースライブラリー調製キット。ロングリードDNA解析に使われる。公式URL Oxford Nanopore TechnologiesRapid Sequencing Kit短時間でナノポアライブラリーを作製するキット。迅速確認や現場解析で使われる。公式URL PacBioSMRTbell Prep KitPacBio HiFiシーケンス向けのライブラリー調製キット。ロングリード高精度解析に使われる。公式URL NEBNEBNext Library Prep KitsIlluminaなどのNGS向けライブラリー調製キット。DNA、RNA、低入力、ターゲット解析などに対応する。公式URL KAPA / RocheKAPA HyperPrep KitsNGSライブラリー調製、増幅、定量に使われるキット。Illumina向けワークフローで広く使われる。公式URL Takara BioSMART-Seq / ThruPLEX関連製品RNA-seq、低入力、シングルセル、DNAライブラリー調製などに使われるNGS関連製品。公式URL QIAGENQIAseq Library KitsDNA/RNAターゲット解析、miRNA、RNA-seqなどに使われるNGSライブラリー調製キット。公式URL MGI TechDNBSEQ Library Prep KitsDNBSEQプラットフォーム向けのライブラリー調製キット。ゲノム、RNA、ターゲット解析に使われる。公式URL
ターゲット濃縮・パネル（8）
Thermo Fisher Scientific / Ion TorrentIon AmpliSeq PanelsPCRベースのターゲットシーケンスパネル。遺伝子パネル、変異解析、アンプリコン解析に使われる。公式URL Thermo Fisher Scientific / Ion TorrentIon AmpliSeq DesignerカスタムIon AmpliSeqパネルを設計できるオンラインツール。目的ターゲットに応じたパネル設計に使われる。公式URL AgilentSureSelect Target Enrichmentハイブリッドキャプチャによるターゲット濃縮製品。エクソーム、カスタムパネル、疾患パネルなどに使われる。公式URL Twist BioscienceTwist Target Enrichment / Custom Panelsハイブリッドキャプチャ型のターゲット濃縮パネル。カスタムパネルや感染症・がん関連パネルなどに使われる。公式URL IDTxGen NGS Panels / Hybridization CaptureNGSターゲット濃縮用プローブ、パネル、アダプター、インデックス製品を展開。公式URL Roche SequencingKAPA HyperCap / AVENIO関連製品ターゲット濃縮、キャプチャ、NGSライブラリー調製に使われる製品群。公式URL IlluminaIllumina DNA Prep with EnrichmentDNAライブラリー調製とターゲット濃縮を組み合わせたワークフロー。エクソームやカスタムパネル解析に使われる。公式URL QIAGENQIAseq Targeted DNA PanelsターゲットDNAシーケンス向けのパネル製品。変異解析やターゲット解析に使われる。公式URL
ライブラリー調製自動化装置（10）
Beckman Coulter Life SciencesBiomek i-SeriesNGSライブラリー調製、核酸抽出、PCRセットアップなどに使われる自動分注システム。公式URL Beckman Coulter Life SciencesBiomek NGS Sample Prep MethodsNGSサンプル前処理を自動化するBiomek用メソッド群。実サンプルで高品質データ生成が確認されたメソッドとして案内されている。公式URL HamiltonMicrolab STARNGSライブラリー調製、核酸抽出、PCRセットアップに使われるリキッドハンドリングシステム。公式URL TecanFluent / Freedom EVO NGS WorkstationsNGSライブラリー調製、核酸抽出、プレート分注の自動化に使われる。公式URL EppendorfepMotionNGS前処理、PCRセットアップ、核酸抽出に使われる自動分注装置。公式URL PerkinElmer / RevvitySciclone / JANUS G3NGSライブラリー調製、核酸抽出、分注ワークフローに使われる自動化システム。公式URL SPT Labtechfirefly / mosquito / dragonfly discoveryNGSライブラリー調製、微量分注、PCRセットアップ、ミニチュア化に使われる。公式URL MGI TechMGISPシリーズDNBSEQ向けNGSライブラリー調製やサンプル前処理を自動化するシステム。公式URL AgilentBravo NGS WorkstationNGSライブラリー調製、ターゲット濃縮、前処理自動化に使われるワークステーション。公式URL OpentronsFlex / OT-2研究用自動分注プラットフォーム。NGSライブラリー調製やPCRセットアップの自動化で使われる。公式URL
断片化・サイズ選択・精製（7）
CovarisME220 / M220 Focused-ultrasonicator音響せん断によるDNA断片化装置。NGSライブラリー調製で均一な断片化に使われる。公式URL Diagenode / HologicBioruptor超音波破砕によるDNA断片化やクロマチン断片化に使われる装置。公式URL Beckman Coulter Life SciencesAMPure XPPCR産物やNGSライブラリーの精製・サイズ選択に使われる磁気ビーズ。公式URL Thermo Fisher ScientificDynabeads / MagMAX関連製品磁気ビーズベースの精製、核酸抽出、ライブラリー調製前後の前処理に使われる。公式URL SPRIselect / Beckman CoulterSPRIselect Reagent KitNGSライブラリーのサイズ選択・精製に使われる磁気ビーズ試薬。公式URL Zymo ResearchDNA Clean & Concentrator KitsDNAクリーンアップ、濃縮、NGS前処理に使われるキット。公式URL QIAGENQIAquick / MinElute KitsPCR産物、DNA断片、ライブラリー調製中間体の精製に使われるカラムキット。公式URL
ライブラリーQC・定量（8）
Thermo Fisher Scientific / InvitrogenQubit FluorometerDNA/RNAやNGSライブラリーの蛍光定量に使われる小型装置。公式URL AgilentTapeStation SystemsDNA/RNA/NGSライブラリーのサイズ分布・品質確認に使われる自動電気泳動システム。公式URL AgilentBioanalyzer Systemsマイクロ流体電気泳動によるDNA/RNA品質、NGSライブラリー品質確認に使われる。公式URL AgilentFragment Analyzer Systems自動パラレルキャピラリー電気泳動によるDNA/RNA/NGSライブラリーQC装置。公式URL Roche / KAPAKAPA Library Quantification KitsIlluminaライブラリーなどのqPCR定量に使われるキット。シーケンス投入量の調整に使われる。公式URL IlluminaLibrary Quantification / QC GuidelinesIlluminaシーケンサー向けライブラリー定量・品質確認の関連情報。公式URL PromegaQuantus Fluorometer蛍光ベースの核酸定量装置。NGSライブラリーや抽出核酸の定量に使われる。公式URL DeNovixDS-11 / QFX Fluorometer微量吸光度測定、蛍光定量に使われる核酸定量装置。公式URL
受託ライブラリー調製・NGS解析サービス（10）
Eurofins GenomicsNGS Servicesライブラリー調製、ターゲット解析、全ゲノム、RNA-seqなどに対応する受託NGSサービス。公式URL Azenta Life Sciences / GENEWIZNGS Servicesライブラリー調製、Amplicon-EZ、全ゲノム、RNA-seq、ターゲット解析などに対応する受託解析サービス。公式URL MacrogenNGS Services全ゲノム、エクソーム、RNA-seq、メタゲノムなどの受託NGS解析に対応。公式URL FasmacNGS受託解析国内向けのNGS受託解析サービス。アンプリコン、メタゲノム、RNA-seqなどに対応。公式URL Takara Bio受託解析サービスNGS、遺伝子解析、シーケンス関連の国内受託解析サービス。公式URL NovogeneNGS Servicesライブラリー調製、全ゲノム、RNA-seq、メタゲノム、ターゲット解析などに対応。公式URL BGI GenomicsNGS Services大規模ゲノム解析、RNA-seq、メタゲノムなどの受託解析サービス。公式URL Charles River LaboratoriesNGS Testing for Adventitious Agent DetectionGMP条件下で外来性ウイルス検出や細胞株特性解析に使われるNGSサービス。公式URL ViruSureNGS Testing for Adventitious Agent DetectionGMP対応のNGS外来性因子検出サービス。既知・未知のウイルス、細菌、マイコプラズマなどの検出に使われる。公式URL PathoQuestNGS-based Biosafety TestingNGSを用いたバイオセーフティ試験、外来性ウイルス検出、細胞治療・ワクチン・バイオ医薬品の品質試験に対応。公式URL
