細胞株開発・クローン選抜
導入遺伝子や発現ベクター、クローン確認に使われる。
主な用途
- クローン確認
Product Guide
Sangerシーケンス
Sangerシーケンスは、DNA配列を1塩基ずつ読み取るための古典的なシーケンス技術です。特定のPCR産物やプラスミド、挿入配列、変異部位などを狙って確認する用途に向いています。
用途・特徴
Sangerシーケンスは、特定のDNA領域の配列を高い信頼性で確認するために使われます。PCRで増幅した領域やプラスミドDNAをテンプレートとして、サイクルシーケンス反応を行い、反応産物をキャピラリー電気泳動で分離して配列を読み取ります。
Point
- 特定領域のDNA配列を確認できる
- プラスミド確認、クローニング確認、PCR産物確認に使われる
- CRISPR編集部位や変異導入部位の確認に使われる
- Sanger反応後にキャピラリー電気泳動で配列を読む
- NGSより小規模・局所的な配列確認に向く
- サーマルサイクラー、シーケンス試薬、キャピラリー電気泳動装置と組み合わせる
- 受託解析サービスとして外部委託されることも多い
使用方法
基本的には、確認したいDNA領域をPCRで増幅し、PCR産物またはプラスミドをテンプレートとしてサイクルシーケンス反応を行います。
1DNAサンプルを準備する
2必要に応じてPCRで対象領域を増幅する
3PCR産物やプラスミドを精製する
4シーケンスプライマーを準備する
5BigDyeなどのSangerシーケンス試薬で反応する
6反応産物を精製する
7キャピラリー電気泳動装置にセットする
8蛍光シグナルを読み取る
9配列データを解析する
10参照配列と比較して確認する
実際の条件は、テンプレートの種類、PCR産物サイズ、プライマー設計、GC含量、反復配列、シーケンス長、解析目的、受託解析の有無によって変わります。
NGSとの違いは？
SangerシーケンスとNGSは、どちらもDNA配列を読む技術ですが、向いている用途が異なります。
結論
Sangerシーケンスは「狙った配列を確認する技術」、NGSは「広く大量に読む技術」と考えるとわかりやすくなります。
主な対象
多数領域、全ゲノム、トランスクリプトーム、メタゲノム
特定のPCR産物、プラスミド、単一領域
読み取り量
非常に多い
少ない
主な用途
外来性ウイルス検出、変異解析、網羅解析、細胞株特性解析
配列確認、クローニング確認、変異確認
強み
網羅性とスループットが高い
結果が解釈しやすい
注意点
ライブラリー調製、解析、データ管理が必要
多数サンプルや低頻度変異には不向き
向く場面
広範囲・多数ターゲット・未知因子探索
狙った配列の確認
キャピラリー電気泳動との関係
| 項目 | 内容 |
|---|---|
| Sangerシーケンス | DNA配列を読む解析法 |
| キャピラリー電気泳動 | Sanger反応産物を分離・検出する装置技術 |
| 主な用途 | 配列確認、クローニング確認、変異確認 |
| 関連装置 | Genetic Analyzer、Spectrum Compact CEなど |
| 関連試薬 | BigDye Terminator、サイクルシーケンス試薬など |
通常PCRとの違いは？
| 項目 | 通常PCR | Sangerシーケンス |
|---|---|---|
| 主な目的 | DNAを増幅する | DNA配列を読む |
| 使用装置 | サーマルサイクラー | サーマルサイクラー＋キャピラリー電気泳動装置 |
| 結果 | PCR産物の有無やサイズ | 塩基配列 |
| 主な確認方法 | ゲル電気泳動、フラグメント解析 | クロマトグラム、配列データ |
| 向く用途 | インサート確認、遺伝子確認 | 配列確認、変異確認、編集確認 |
主な用途
| 用途 | 内容 | 主な場面 |
|---|---|---|
| プラスミド配列確認 | クローニングしたプラスミドの挿入配列を確認する | mRNA鋳型、AAVプラスミド、発現ベクター |
| クローニング確認 | インサート配列や変異導入部位を確認する | 細胞株開発、遺伝子導入、研究開発 |
| PCR産物確認 | PCRで増幅した目的領域の配列を確認する | 遺伝子確認、細胞同一性、変異確認 |
| CRISPR編集確認 | 編集部位周辺の配列を確認する | 遺伝子編集、細胞株構築 |
| 細胞同一性確認 | 特定遺伝子やSTR周辺の確認に使われる場合がある | セルバンク、細胞株確認 |
| 変異確認 | 点変異、挿入、欠失を確認する | 変異導入、クローン確認 |
| ウイルスベクター確認 | ベクター配列や挿入配列を確認する | AAV、レンチウイルス、遺伝子治療 |
| 菌株・プラスミド確認 | 大腸菌コロニーやプラスミドの配列確認 | プラスミドDNA製造、微生物発酵 |
選定ポイント
運用形態自社解析か、受託解析か
サンプル数少数サンプルか、多数サンプルか
テンプレートPCR産物、プラスミド、BAC、コロニー、未精製サンプルなど
読み取り長必要なリード長、配列品質
難読配列GCリッチ、反復配列、二次構造に対応できるか
装置SeqStudio、3500、Spectrum Compact CEなど
試薬BigDye、サイクルシーケンス試薬、精製試薬
前処理PCR、PCR産物精製、シーケンス反応精製
解析ソフトクロマトグラム確認、アライメント、変異確認
GMP対応試験法、データ記録、監査証跡、LIMS連携の要否
コスト装置、保守、試薬、受託費用、ランニングコスト
サポート国内保守、受託解析の納期、トラブル時対応
使用される工程
遺伝子導入・安定発現株作製
挿入配列、ベクター構造、変異導入部位の確認に使われる。
主な用途
- 挿入確認
セルバンク
細胞同一性確認、導入配列確認、細胞株確認に関係する。
主な用途
- 同一性確認
汚染確認・安全性評価
細胞同一性や特定配列確認の一部で使われる。
主な用途
- 安全性確認
プラスミドDNA製造
プラスミド配列、インサート、プロモーター、polyA配列などの確認に使われる。
主な用途
- 配列確認
AAV製造
AAVプラスミド、ベクター配列、構築確認に使われる。
主な用途
- 構築確認
レンチウイルス製造
ベクター構築、導入配列、パッケージング関連配列確認に使われる。
主な用途
- ベクター確認
mRNA-LNP製造
プラスミド鋳型やLinear DNAの配列確認に関係する。
主な用途
- 鋳型確認
遺伝子編集
編集部位周辺の配列確認、クローン確認に使われる。
主な用途
- 編集確認
品質評価・分析
特定配列確認、変異確認、原材料確認に使われる。
主な用途
- 変異確認
研究開発
クローニング、変異導入、プラスミド確認、遺伝子確認に広く使われる。
主な用途
- 配列確認
使用されるモダリティー
抗体医薬
関連度中〜高
発現ベクター細胞株開発セルバンク確認
導入配列やクローン確認に使われる。
ADC
関連度中〜高
抗体原薬用発現ベクターCHO細胞
抗体部分の遺伝子構築確認で関係する。
二重特異性抗体
関連度中〜高
複数鎖の発現ベクター配列確認
重鎖・軽鎖や設計配列の確認に使われる。
Fc融合タンパク質・組換えタンパク質
関連度中〜高
発現ベクター配列確認細胞株開発
組換えタンパク質の遺伝子配列確認に使われる。
AAV
関連度高
プラスミドITR周辺導入遺伝子
AAVプラスミドやベクター構築確認に使われる。
レンチウイルス
関連度高
ベクター構築導入配列パッケージング関連確認
遺伝子治療・細胞治療ベクターの確認に関係する。
プラスミドDNA
関連度高
プラスミド構築インサート変異確認
mRNAやAAV原料の配列確認に使われる。
mRNA-LNP
関連度高
プラスミド鋳型Linear DNA
mRNA合成前のテンプレート配列確認に関係する。
細胞治療
関連度高
CAR配列導入遺伝子編集部位
CAR-Tや遺伝子導入細胞の確認に使われる。
iPS細胞・幹細胞由来製品
関連度中〜高
遺伝子編集細胞確認配列確認
編集部位や導入配列の確認に関係する。
遺伝子編集
関連度高
CRISPR編集部位変異確認クローン確認
編集結果の確認に使われる。
ワクチン
関連度中
細胞基材ウイルスシード配列確認
構築物やウイルス関連配列確認に使われる。
微生物発酵
関連度高
菌株確認プラスミド確認遺伝子確認
発酵菌株や発現プラスミドの確認に使われる。
低分子医薬品
関連度低〜中
細胞アッセイ評価細胞研究用途
製造工程よりも研究・評価系で限定的に使われる。
メーカー製品
Sangerシーケンス装置・キャピラリー電気泳動装置（7）
Thermo Fisher Scientific / Applied BiosystemsSeqStudio Genetic AnalyzerSangerシーケンスとフラグメント解析に対応するベンチトップ型キャピラリー電気泳動装置。低〜中スループットの配列確認に使われる。公式URL Thermo Fisher Scientific / Applied BiosystemsSeqStudio Flex Genetic AnalyzerSangerシーケンスとフラグメント解析に対応するSeqStudioシリーズの拡張モデル。複数キャピラリー構成でスループットに応じて選択できる。公式URL Thermo Fisher Scientific / Applied Biosystems3500 Genetic Analyzer8キャピラリー構成の遺伝子解析装置。Sangerシーケンス、フラグメント解析、STR解析に使われる。公式URL Thermo Fisher Scientific / Applied Biosystems3500xL Genetic Analyzer24キャピラリー構成の遺伝子解析装置。Sangerシーケンスやフラグメント解析の高スループット運用に使われる。公式URL Thermo Fisher Scientific / Applied Biosystems3730xl DNA Analyzer高スループットのキャピラリー電気泳動装置。大量のSangerシーケンスやフラグメント解析に使われる。公式URL PromegaSpectrum Compact CE SystemSangerシーケンスとフラグメント解析に対応するベンチトップ型キャピラリー電気泳動装置。公式URL PromegaSpectrum CE SystemSTR解析やフラグメント解析に使われるキャピラリー電気泳動装置。Sangerシーケンス周辺用途とも関連する。公式URL
Sangerシーケンス試薬（8）
Thermo Fisher Scientific / Applied BiosystemsBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing KitSangerシーケンス用の代表的なサイクルシーケンスキット。PCR産物、プラスミド、fosmid、BACテンプレートなどの配列確認に使われる。公式URL Thermo Fisher Scientific / Applied BiosystemsBigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit短いPCR産物や特定用途のSangerシーケンス反応に使われるサイクルシーケンスキット。公式URL Thermo Fisher Scientific / Applied BiosystemsBigDye Direct Cycle Sequencing KitPCRとシーケンスを簡略化するためのSangerシーケンス関連キット。PCR産物の直接シーケンスに使われる。公式URL Thermo Fisher Scientific / Applied BiosystemsBigDye XTerminator Purification KitBigDye反応後の精製に使われるキット。キャピラリー電気泳動前の反応クリーンアップに使われる。公式URL Thermo Fisher Scientific / Applied BiosystemsExoSAP-IT PCR Product Cleanup ReagentPCR産物中のプライマーやdNTPを分解し、Sangerシーケンス前処理に使われるクリーンアップ試薬。公式URL PromegaGoTaq DNA Polymerase / PCR Master MixesSanger前処理PCRや配列確認用PCRに使われるPCR試薬。公式URL Takara BioPrimeSTAR / Ex Taq / PCR試薬Sanger前処理PCR、クローニング確認、配列確認用PCRに使われる試薬。公式URL NEBQ5 High-Fidelity DNA Polymerase高正確性PCRに使われるDNAポリメラーゼ。シーケンス前処理やクローニング確認に使われる。公式URL
サーマルサイクラー・PCR前処理（7）
Thermo Fisher Scientific / Applied BiosystemsVeritiPro Thermal CyclerPCR増幅やサイクルシーケンス反応に使われるサーマルサイクラー。温度制御、接続性、96ウェル構成に対応する。公式URL Thermo Fisher Scientific / Applied BiosystemsSimpliAmp Thermal CyclerコンパクトなPCRサーマルサイクラー。Sanger前処理PCRやサイクルシーケンス反応に使われる。公式URL Bio-RadT100 Thermal Cycler96ウェル対応のコンパクトなサーマルサイクラー。PCR条件検討やSanger前処理に使われる。公式URL Bio-RadC1000 Touch Thermal Cycler交換式ブロックに対応するサーマルサイクラー。PCR増幅や条件検討に使われる。公式URL EppendorfMastercycler X50高速ランプレート、2Dグラジエント機能、ネットワーク接続に対応するサーマルサイクラー。公式URL Takara BioTaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch国内向けのPCRサーマルサイクラー。グラジエント機能やタッチパネル操作に対応する。公式URL Analytik JenaBiometra TAdvanced高性能サーマルサイクラー。交換式ブロックやグラジエント機能に対応する。公式URL
PCR産物・シーケンス反応精製（7）
Thermo Fisher Scientific / Applied BiosystemsBigDye XTerminator Purification KitBigDye反応後のクリーンアップに使われるキット。キャピラリー電気泳動前処理に使われる。公式URL Thermo Fisher Scientific / Applied BiosystemsExoSAP-IT PCR Product Cleanup ReagentPCR産物中の残存プライマーやdNTPを処理するクリーンアップ試薬。Sanger前処理に使われる。公式URL Beckman Coulter Life SciencesAgencourt CleanSEQSangerシーケンス反応産物の精製に使われる磁気ビーズベースのクリーンアップ試薬。公式URL Cytivaillustra ExoProStar / GFX PCR DNA and Gel Band Purification KitPCR産物やDNA断片の精製に使われる製品群。Sanger前処理で使われる。公式URL QIAGENQIAquick PCR Purification KitPCR産物の精製に使われるカラムキット。Sangerシーケンス前処理に使われる。公式URL PromegaWizard SV Gel and PCR Clean-Up SystemPCR産物やゲル抽出DNAの精製に使われるキット。公式URL NEBMonarch PCR & DNA Cleanup KitPCR産物やDNA断片の精製に使われるキット。公式URL
解析ソフト・データ管理（8）
Thermo Fisher Scientific / Applied BiosystemsSequencing Analysis SoftwareSangerシーケンスデータのベースコールやクロマトグラム確認に使われるソフトウェア。公式URL Thermo Fisher Scientific / Applied BiosystemsSeqScape SoftwareSangerシーケンスデータのアライメント、変異確認、配列比較に使われるソフトウェア。公式URL Thermo Fisher Scientific / Applied BiosystemsVariant Reporter SoftwareSangerシーケンスデータの変異確認やレポート作成に使われるソフトウェア。公式URL GeneiousGeneious PrimeSanger、NGS、クローニング、配列アライメント、プラスミドマップ作成に使われる解析ソフト。公式URL SnapGeneSnapGeneプラスミドマップ、配列確認、クローニング設計、Sangerトレースとの照合に使われるソフトウェア。公式URL DNASTARLasergeneSanger、NGS、配列アライメント、変異解析、クローニング確認に使われるソフトウェア。公式URL BenchlingBenchling Platform配列管理、プラスミド設計、実験記録、サンプル管理に使われるクラウドプラットフォーム。公式URL Thermo Fisher ScientificSampleManager LIMSシーケンス結果、サンプル情報、品質試験データ管理に使われるLIMS。公式URL
受託解析サービス（10）
Eurofins GenomicsDNAシーケンスサービス国内向けのSanger DNAシーケンス受託サービス。解析結果は最短でサンプル到着日に報告されるサービスとして案内されている。公式URL Eurofins GenomicsSanger SequencingPCR産物やプラスミドなどのSangerシーケンス受託サービス。米国・欧州などでも展開される。公式URL Azenta Life Sciences / GENEWIZSanger SequencingDNA配列決定の受託サービス。プラスミド、PCR産物、未精製PCR産物、コロニーなどに対応する。公式URL FasmacDNAシーケンス解析国内向けのSangerシーケンス受託サービス。プラスミド、PCR産物、フラグメント解析などに対応する。公式URL Takara BioDNAシーケンス解析サービス国内向けのDNAシーケンス受託解析サービス。研究・開発用途の配列確認に使われる。公式URL MacrogenSanger SequencingSangerシーケンス、NGS、遺伝子解析などの受託解析サービスを提供する。公式URL MicrosynthSanger SequencingSangerシーケンス、フラグメント解析、細胞株認証関連解析に対応する受託サービス。公式URL GenScriptSanger SequencingSangerシーケンス、遺伝子合成、プラスミド構築、配列確認に関係するサービスを展開。公式URL Quintara BiosciencesSanger Sequencing研究向けSangerシーケンス受託サービス。プラスミドやPCR産物の配列確認に使われる。公式URL PlasmidsaurusPlasmid SequencingNanoporeベースの全長プラスミドシーケンスが中心だが、プラスミド配列確認の受託候補として比較される。公式URL
