IC50の4パラメータロジスティック(4PL)フィッティングの求め方

核心は一点だけです。報告されたIC50が有効数字何桁かではなく、その数字を生んだ曲線が両側の平坦域まで実測に支えられているかどうかが、値の信頼性を決めます。上限や下限を都合よく決めてしまえば、中点であるIC50はいくらでも動きます。逆に言えば、上限と下限さえ実測で押さえられれば、IC50は再現できる数字に変わります。

本稿では、4PLの4つのパラメータが曲線のどこを担うのかから、上下限を固定してよい条件、点数と希釈系列の設計、曲線が左右対称にならないときの5PLという選択肢、そしてIC50とEC50応答を半分まで立ち上げる濃度のことで、作動薬など活性化系の効力指標に使う。詳しく →・Ki・Kdの違いまで、判断の分かれる順に整理します。

4PLの4パラメータが担うもの ― IC50は中点の相対値

4PLは上限・下限・Hill係数・IC50の4つで、S字の用量反応曲線濃度を振ったときの応答の変化を表す曲線で、ここからIC50やEC50を導く。詳しく →を表します。この4つを同時に動かし、残差平方和が最小になる曲線を探します。それがあてはめの中身です。

たとえば同じデータからIC50 = 12.3 nMという値が出たとしても、それは生データから直接読み取った数字ではありません。上限の平坦域と下限の平坦域を結ぶ曲線の、ちょうど中間の応答を与える濃度として、あとから計算された値です。上限や下限の推定が動けば、中点であるIC50も一緒に動きます。Hill係数用量反応曲線の遷移域での急峻さを表すパラメータ。1から大きく外れると複数の結合部位や非特異的効果を疑う。は遷移域での曲線の急峻さを表し、1に近いほど緩やかに切り替わり、絶対値が大きいほど狭い濃度域で応答が切り替わることを意味します。

ここでよくある誤読が1つあります。Hill係数が1から離れると、複数の結合部位や協同性のしるしだと読みたくなりますが、4PLS字型の用量反応曲線を下限・上限・傾き・中間用量の四つで表すモデル。相対力価の算出に使う。はあくまで経験式で、なぜ急なのかまでは教えてくれません。遷移域の点数が薄くノイズが乗っただけでも、Hill係数は同じように1から離れます。

IC50は生データから読み取る値ではなく、上限・下限・Hill係数を含む曲線全体から相対的に決まる推定量です。

上限・下限を固定してよいか ― 対照ウェルの実測が条件

正規化したデータでは、上限を100%、下限を0%に固定して2パラメータで解く方法がよく採られます。操作は手軽です。ただし、その固定が妥当かどうかは条件しだいです。

固定が妥当なのは、対照ウェル（無処理とブランク）で平坦域が実測により裏づけられている場合に限られます。無処理側の応答がきちんと頭打ちになっているか、最大阻害側の応答も別の平坦域まで届いているか。どちらも生データの上で確認できて初めて、固定に根拠が生まれます。データがどちらかの平坦域まで届いていないのに固定すると、見かけ上きれいに合っても、IC50は実態からずれます。Molecular DevicesのSpectraMax M SeriesやTecanのSparkのようなマルチモードリーダーで無処理ウェルの吸光や発光を測っておけば、この頭打ちを生データの上で確認できます。

ソフトウェアに聞くべきは、当てはまりの良さを示すR²の値ではなく、上限と下限それぞれの標準誤差がいくつあるかです。R²が高くても、平坦域が薄ければ標準誤差は大きいままで、そこにIC50のブレが隠れています。

平坦域が実測で支えられているときに限って、上下限の固定は正当化されます。

点数・希釈系列の設計と外挿の危うさ

あてはめの質は、どの濃度に何点置くかで大きく変わります。目安は少なくとも3 log以上の濃度域に8〜12点、各濃度に2〜3反復です。

配置は遷移域、おおよそ応答が75%から25%に収まる範囲を厚くするのがコツです。ADCC抗体FcがNK細胞などのFcγRIIIaに結合し、そのエフェクター細胞に標的細胞を傷害させる作用。詳しく →の作用機序薬が効果を発揮する仕組み。抗体医薬ではADCCやCDCなどが該当し、アッセイで裏づける。詳しく →を反映するPromegaのADCC Reporter Bioassayや、Svar Life ScienceのiLite、BPS BioscienceやInvivoGenのJurkat系レポーター細胞では、エフェクター細胞と標的細胞の比を5対1前後に揃え、Bio-Glo系の発光基質を加えて数時間置いたところを、BMG LABTECHのCLARIOstar PlusやPerkinElmerのEnVisionといったマルチモードリーダーで読みます。

希釈系列には見落としやすい落とし穴があります。段階希釈は誤差が末端に向けて積み上がりやすく、各ステップに10%程度の系統誤差測定のたびに同じ方向に偏ってしまう誤差で、ランダム誤差とは異なり繰り返し測定しても平均化されない。があると、12点系列の反対端では誤差が累積して3〜5倍規模の濃度ずれになり得ます。希釈設計しだいでIC50が系統的に動く余地がある、という点は頭に置いておく必要があります。

外挿はさらに注意が要ります。応答が遷移域に入らず平坦域も取れていないデータでは、測定ノイズしだいで多数の異なるS字がほぼ同等に当てはまり、推定されるIC50が大きく揺れます。こうしたばらつきの評価には、アッセイ品質の指標としてZ因子アッセイのシグナルとバックグラウンドの分離のよさを、差とばらつきから一つの数値で表す品質指標。詳しく →で系そのものの再現性を先に確かめておくと、フィッティングのブレとアッセイのブレを切り分けやすくなります。

曲線が左右対称にならないとき ― 5PLという選択肢

4PLは、変曲点をはさんで曲線が左右対称になることを前提に置いています。実際の用量反応は、いつもその形に収まるとは限りません。GraphPad PrismやSoftMax Proでは、同じ操作画面から4PLと5PLのどちらでもあてはめを選べます。

立ち上がりは急なのに、頭打ちへ近づく側がだらだらと伸びる、といった非対称なS字が出ることがあります。原因は系によってさまざまで、複数の結合部位、細胞応答の飽和のしかた、検出系の応答特性などが絡みます。こうした曲線に4PLを無理に当てると、遷移域はよく合っているのに平坦域が実測から外れ、その結果として中点であるIC50がずれます。対処として、非対称の度合いを表すパラメータをもう1つ足した5パラメータロジスティック(5PL)を使う方法があります。

4PLで押し通すか5PLに切り替えるかは、どちらが正しいという話ではありません。パラメータを増やせば当てはまりは必ず良くなるので、残差が小さくなったこと自体は5PLを選ぶ根拠になりません。非対称が系の性質として説明できるか、そして点数と反復がパラメータを1つ増やすだけの情報量を持っているかで決まります。力価試験としてIC50や相対力価を報告する場面では、ICH Q6Bのもとでデータ解析をUSP〈1034〉やPh. Eur.欧州医薬品品質局（EDQM）が発行する、医薬品の品質基準を定めた公定書で、署名国・加盟国の規制に法的効力を持つ。詳しく → 5.3の4PLまたは平行線モデルに従わせ、Fieller定理で95%信頼区間を求めるのが標準です。同じデータでも4PLと5PLではIC50が変わるため、どちらで報告するかは、相対力価の設計の段階で試験法として先に決めておきます。

当てはまりの良さだけでは、4PLと5PLのどちらを選ぶ根拠になりません。

IC50とEC50・Ki・Kdの違い ― 相対値と定数の境目

近い記号が並ぶため混同しやすいのですが、指す対象はそれぞれ違います。IC50は応答を半分に抑える濃度です。EC50は半分まで立ち上げる濃度です。向きは逆です。

より本質的な違いは、IC50が実験条件に左右される相対値である一方、KiやKdはより条件に依存しにくい定数だという点です。IC50は基質濃度や標的量などの条件で動くため、系をまたいで直接比べにくい面があります。競合阻害では、IC50とKiはCheng-Prusoff式競合阻害でIC50とKiを結びつける関係式。基質濃度とその親和性が分かればIC50からKiを見積もれる。で結びつけられます。基質の濃度とその親和性抗体が抗原に結合する強さ。解離定数などで表し、値が小さいほど強く結合することを示す。詳しく →(Km)が分かっていれば、基質濃度をKmの1倍に合わせたとき、KiはIC50のおよそ半分に近づきます。この関係から、競合阻害ではIC50は常にKiより大きくなります。ただしCheng-Prusoff式は条件によって過大・過小に評価されるとされ、低濃度域などでは別の解析が推奨されることもあります。

KdはCytivaのBiacoreやSartoriusのOctetといった結合速度論の測定から、結合と解離薬分子が水溶液中で電荷を帯びたイオン型と電荷を持たない非イオン型に分かれる現象で、体内のpH環境によって割合が変化する。詳しく →それぞれの速度定数を通じて求められます。酵素阻害系ではKiがKdに近い意味を持つ場面もあります。数値を報告するときは、どの系・どの条件で得たIC50かを併記しておくと、後の比較で誤解を避けられます。

IC50は使い勝手のよい相対指標ですが、条件をまたいで親和性を比べるならKiやKdへ橋渡しして考える必要があります。

フィッティング前に決めておく順番

最後に、判断の順番を整理します。

まず、報告の形式を決めます。IC50を単独の点推定として報告するのか、標準品に対する相対力価検体の力価を標準品と比べて表す値。生物系の日間変動を比で打ち消せる。詳しく →として4PLか平行線モデルで報告するのか。これを試験法として先に決めます。ここが曖昧だと、あとの設計がすべて手戻りします。

次に、対照ウェルを確認します。上下限の平坦域が実測できているかどうかです。無処理とブランクの応答が、きちんと頭打ちになっている必要があります。そこまで確認できて初めて、上限100%・下限0%の固定に根拠が生まれます。

そのうえで、希釈系列を設計します。3 log以上の濃度域に8〜12点を置き、遷移域を2倍刻みで厚くし、各濃度に2〜3反復を確保します。

あてはめが済んだら、R²だけでなく、各パラメータの標準誤差と95%信頼区間をソフトウェアの出力から確認します。ここが広ければ、点数を増やすか濃度域を見直します。

最後に、曲線の非対称さが系の性質として説明できるなら、5PLへの切り替えを検討します。条件をまたいで親和性を比べる必要があるなら、KiやKdへの橋渡しをあらかじめ計画に入れておきます。

参考文献

• Sebaugh JL. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 2011;10(2):128-134.
• NIH/NCATS, Assay Guidance Manual ― Assay Operations for SAR Support（Curve Fitting）
• Cheng Y, Prusoff WH. Relationship between the inhibition constant (Ki) and the concentration of inhibitorトランスポーターの働きをふさぐ薬。他の基質薬の輸送を妨げ、短期間で濃度を変える。詳しく → which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochem Pharmacol. 1973;22(23):3099-3108.
• FDA, Potency Tests for Cellular and Gene Therapy Products（Guidance for Industry, 2011）
• USP 〈1034〉 Analysis of Biological Assays（有償の薬局方章。米国薬局方米国で医薬品・原料・試験法の公式基準を定める公定書で、製薬用水に関する規格も収載されている。詳しく →の公式サイトを参照）