ペプチド医薬の固相合成（SPPS）と製造の要点

SPPSの出発点は、樹脂（固体の担体）に最初のアミノ酸を共有結合で固定することです。そこへ次のアミノ酸を一つずつ結合させて鎖を伸ばしていく。1残基を足すたびに「カップリング露出した5'水酸基に次の塩基のアミダイトを結合させ、鎖を1塩基伸ばす工程。（結合）→脱保護合成した核酸を担体から切り出し、保護基を外して純粋な鎖にする工程。（保護基化学合成中に反応させたくない官能基を一時的にマスクする化学基で、目的の反応後に除去されてもとの官能基が露出する。外し）」という数工程を1サイクルとして繰り返し、配列の長さのぶんだけこのサイクルを回します。目的の鎖は樹脂に固定されたまま動かないため、各工程のあいだに溶媒で洗えば過剰な試薬や副生成物を流し落とせる。この「固定して洗える」点が、溶液中で行う合成にはない大きな利点です。

もっとも、利点だけではありません。1サイクルの取りこぼしが最終純度にじわじわ効いてくること、そしてアミノ酸には20種類の側鎖があるぶん核酸より副反応の種類が多いこと——これがペプチドならではの難しさです。ここではFmoc法を軸に、基本サイクルから欠失・エピマー化・凝集といった副生成物、分取HPLC高速液体クロマトグラフィーを大流量・大カラムスケールで運用し、目的ペプチドを不純物から分離・回収する精製技術。による精製、長鎖・難配列の課題、液相・ハイブリッドや環状化までをたどり、最後に同じ固相合成であるオリゴ核酸DNAやRNAの短い鎖を化学合成でつないだ分子で、核酸医薬原薬の多くを占める。との違いも見比べてみます。

SPPSの基本 ― 樹脂・カップリング・脱保護の繰り返し

ペプチド複数のアミノ酸がペプチド結合でつながった中分子化合物で、タンパク質より鎖が短いものを指す。とは、あるアミノ酸のカルボキシ基（酸の部分）と次のアミノ酸のアミノ基（塩基の部分）がつながったアミド結合（ペプチド結合）の連なりです。SPPSでは、この結合を一つずつ、決まった方向に作っていきます。伸長方向はC末端（カルボキシ末端）からN末端（アミノ末端）へ向かう向きで、生体内でリボソームが作る方向（N→C）とは逆になります。

出発点は、C末端側のアミノ酸を樹脂（ポリスチレン系やPEG系のビーズ）に共有結合で固定するところです。その状態から、1残基を足すための工程を1サイクルとして繰り返していきます。

• カップリング⁠：次に足すアミノ酸のカルボキシ基を、縮合剤で活性化T細胞を抗原刺激や人工的な刺激試薬で活性化し、増殖・機能発揮できる状態に誘導する操作。して、樹脂上の鎖のアミノ基と結合させます。反応を確実にするため、アミノ酸も縮合剤も大過剰で加えるのが一般的です。
• 脱保護⁠：新しく足したアミノ酸のアミノ基（α-アミノ基）は保護基で塞いであります。これを外して、次のカップリングに使える状態にします。
• 洗浄⁠：各工程の前後で溶媒を流し、過剰試薬や副生成物を洗い落とします。

ここで押さえておきたいのが、各アミノ酸には二種類の保護がかかっている点です。一つは伸長のたびに外す一時的な保護（α-アミノ基）、もう一つは合成のあいだずっと外さない側鎖の保護。側鎖の保護は、反応させたくない側鎖（例：リシンのアミノ基、アスパラギン酸のカルボキシ基）が余計な反応をしないよう塞いでおくためで、合成が全部終わってから樹脂切り出しとまとめて外します。 SPPSは「カップリング→α-アミノ基の脱保護」を配列長のぶん繰り返し、側鎖保護反応させたくないアミノ酸の側鎖を合成中ずっと塞いでおき、最後にまとめて外す保護。は最後にまとめて外す、という二段構えの保護戦略で成り立っています。

Fmoc法とBoc法 ― いまの主流はFmoc

α-アミノ基の一時保護には、大きくFmoc法α-アミノ基を塩基で外し、側鎖保護と樹脂からの切り出しを酸で行う、現在主流のペプチド合成法。とBoc法α-アミノ基を酸で毎サイクル外し、最終の切り出しに強酸を使うペプチド合成の保護戦略。の二つの系統があります。両者の違いは、保護基を外す条件と側鎖保護の外し方の設計にあります。

Fmocα-アミノ基を塩基で外し、側鎖保護と樹脂からの切り出しを酸で行う、現在主流のペプチド合成法。（フルオレニルメチルオキシカルボニル）法は、α-アミノ基のFmoc基を塩基（ピペリジンが代表的）で外し、側鎖保護と樹脂からの切り出しは酸（TFA：トリフルオロ酢酸）で行います。塩基で外すものと酸で外すものが分かれているため、伸長の途中で側鎖保護が誤って外れにくく、扱いも比較的おだやか。フッ化水素のような強酸を最終処理に使わずに済むこともあり、現在の医薬品ペプチド製造ではFmoc法が主流になっています。

Bocα-アミノ基を酸で毎サイクル外し、最終の切り出しに強酸を使うペプチド合成の保護戦略。（tert-ブトキシカルボニル）法は、α-アミノ基のBoc基を酸（TFA）で毎サイクル外し、最終的な切り出しにはフッ化水素などの強酸を使います。取り扱いに注意を要する試薬を使う一方で、一部の難しい配列では有利とされる場面もあり、いまも用途によって選ばれます。

Fmoc脱保護には長くピペリジンが使われてきましたが、後述するアスパルチミド形成アスパラギン酸を含む配列で隣の骨格が環を巻き、五員環になる副反応。を抑える目的で、ピペラジンや別のアミンを組み合わせる条件も検討されています（配列や装置によって選択は変わります）。 いまの医薬品ペプチド製造ではFmoc法が主流で、塩基での脱保護と酸での切り出しという直交原理（物差しの向き）の異なる手法を重ねて品質を評価する考え方。単一手法の死角を減らす。性が扱いやすさの土台になっています。

副生成物 ― 欠失・エピマー化・凝集

SPPSの純度製品にどれだけ目的物質だけが含まれ、不純物や変性体が少ないかを示す指標です。抗体では単量体の割合やサイズの異なる成分の量などを見ます。詳しく →は、各サイクルがどれだけ完結するかに強く依存します。ペプチドでは核酸にはない側鎖由来の副反応も加わるため、副生成物の種類が多くなりがちです。代表的なものを整理します。

• 欠失体（deletion／truncatedあるサイクルでカップリングが取りこぼされ、その残基が抜けた全長より短いペプチド。）：あるサイクルでカップリングが取りこぼされ、その残基が抜けた鎖です。全長（n）に対して1残基少ないもの（n-1相当）などが生じます。全長体と構造がよく似ているため、後述の精製でもっとも分離しにくい不純物です。核酸のキャッピングmRNAの5'末端にキャップ構造を付ける修飾で、分解を防ぎ翻訳効率を高めます。3'末端のポリA付加とは別の修飾です。詳しく →に相当する「途中終結させて短鎖に追い出す」操作（キャッピング）を入れる設計もありますが、必ずしも標準ではありません。
• エピマー化アミノ酸のα炭素の立体配置が反転し、本来のL体にD体が混じる副反応。（ラセミ化アミノ酸のα炭素の立体配置が反転し、本来のL体にD体が混じる副反応。）：アミノ酸のα炭素の立体配置が反転し、本来のL体にD体が混じる副反応です。カップリング時に活性化されたカルボキシ基のところで起きやすく、とくにヒスチジンやシステインなどで問題になりやすいとされます。生じるジアステレオマーホスホロチオエート骨格などで生じる立体異性体で、質量が同じため見分けにくい。（立体異性体）は全長体と分子量が同じで性質も近いため、分離が難しい不純物です。
• アスパルチミド形成⁠：アスパラギン酸を含む配列で、隣接する骨格が環を巻いて五員環（アスパルチミド）になる副反応です。Fmoc脱保護の塩基条件や最終のTFA処理で進みやすく、環が開くときに元とは違うつながり方（β-結合）やエピマー化を伴う複数の不純物を生みます。特定の配列で起きやすいため、脱保護条件や保護基の選び方で抑えます。
• 凝集（オンレジン凝集伸長中のペプチド鎖どうしが樹脂上で会合し、試薬が届きにくくなる現象。）：伸長中の鎖どうしが樹脂上で会合し、試薬が届きにくくなる現象です。疎水性の高い配列や特定の並びで起きやすく、カップリングや脱保護の効率が落ちて欠失体が増える原因になります。加温や擬似プロリン配列に一時的な折れ曲がりを導入し、伸長中の凝集を抑えるために使う修飾。といった工夫で緩和します。

欠失体あるサイクルでカップリングが取りこぼされ、その残基が抜けた全長より短いペプチド。とエピマー体に共通するのは、全長体との性質差が小さく、精製で除きにくい点です。だからこそ、上流のサイクルを高い効率で完結させ、副反応を起こしにくい条件を選ぶことが純度づくりの前提になります。 ペプチドの副生成物は欠失・エピマー化・アスパルチミド・凝集と種類が多く、とくに欠失体とエピマー体は全長体と似ていて精製で除きにくいのが要点です。

分取HPLCによる精製

樹脂から切り出した粗ペプチドには、欠失体・エピマー体・側鎖保護外し由来の副生成物などが混在しています。全長・正配列の目的物を取り出す精製の主役が、分取（プレパラティブ）逆相HPLC疎水性の差でペプチドやオリゴを分離する液体クロマトグラフィーのこと。です。

逆相HPLCは、ペプチドの疎水性の差を使って分けます。カラム（充填剤を詰めた管）に粗ペプチドを流し、移動相の組成を少しずつ変えながら疎水性の違いで溶出のタイミングをずらして分画する。1残基の違いや立体異性の違いを分けるには、勾配のかけ方やカラム、移動相の添加剤（イオンペア試薬オリゴ核酸などの分析で、逆相カラムへの保持を高めて分離を良くするため移動相に加える試薬です。詳しく →など）を丁寧に選ぶ必要があります。工業スケールでは、分離の選択性目的物と不純物を、溶出位置をどれだけ離して分けられるかの度合い。分離の分解能を左右する。を変えるために移動相を替えた二段階の精製（直交精製）を組む設計も一般的です。

精製で押さえておきたい考え方を整理します。

どの手法を使っても、全長体との差が小さいn-1相当の欠失体やエピマー体を完全に除くのは容易ではありません。上流の合成でこれらを作り込まないことが、最終純度を左右する前提になります。 分取逆相HPLCは疎水性差で分ける強力な手法ですが、欠失体・エピマー体は分離が難しく、上流のサイクル効率と副反応抑制での作り込みが最終純度を決めます。

長鎖・難配列の課題とハイブリッド・環状化

50残基を超えるあたりから、SPPS単独では収率と純度の確保が厳しくなるとされます（配列の性質によって大きく変わります）。背景には二つの理由があります。一つは、サイクル数が増えるぶん取りこぼしが積み重なり、全長体の割合がサイクル効率の累乗で下がること。もう一つは、鎖が長くなると前述の凝集が起きやすく、カップリングや脱保護の効率そのものが落ちることです。十数残基程度までは比較的まわりやすいSPPSも、鎖が伸びるほど難しさが増します。

こうした長鎖・難配列には、いくつかの打ち手があります。

• フラグメント縮合（ハイブリッド合成）：長い鎖を一気に伸ばすのではなく、扱いやすい長さのフラグメント（部分ペプチド）をSPPSで別々に作り、それらを溶液中でつなぎ合わせる方法です。各フラグメントを精製してから縮合できるため、最終品の純度を確保しやすくなります。
• 液相合成（LPPS）との併用⁠：フラグメントの縮合や特定の残基の導入を溶液中で行う設計です。大スケールでは、洗浄で試薬を流すSPPSと、大量合成に向く液相を組み合わせるハイブリッドが選ばれることもあります。
• 化学的ライゲーション⁠：ネイティブケミカルライゲーション（NCL）のように、保護基を外したフラグメント同士を特定の化学で選択的につなぐ手法です。より長いペプチド・小型タンパク質の化学合成で使われます。

環状ペプチド（頭尾や側鎖同士をつないで環にしたもの）を作る場合は、環化（サイクリゼーション）の工程が加わります。樹脂上で行う場合と、切り出した後に溶液中で行う場合があり、後者では鎖同士がつながる分子間反応（重合）を抑えるために薄い濃度で反応させるのが一般的です。これがスループットの制約になります。ジスルフィド結合（システイン同士のS-S結合）で環や架橋を作る場合は、酸化条件や保護基を外す順番を設計して、狙った位置の結合だけを選択的に作る工夫が要ります。 長鎖・難配列ではSPPS単独に固執せず、フラグメント縮合や液相とのハイブリッドで純度を確保する設計が現実的で、環状化はさらに環化工程の設計が加わります。

オリゴ核酸のSPPSとの対比

同じ「固相担体に固定して一単位ずつ伸ばす」合成でも、ペプチドとオリゴ核酸では設計思想がかなり異なります。核酸の合成についてはオリゴ核酸の固相合成で詳しく整理していますが、ここでは対比の要点をまとめます。

核酸は塩基が4種類で側鎖の反応性が限られるぶん、副反応は欠損体（n-1など）が中心で、立体異性の問題はほとんど起きません。骨格が負電荷を持つため、電荷の数の差で分けるイオン交換という強力な精製手段も使えます。

ペプチドはアミノ酸が20種類あり側鎖の化学が多様なぶん、エピマー化やアスパルチミドといった配列依存の副反応が加わります。骨格に一定の電荷がないため、精製は主に疎水性差を使う逆相HPLCが担い、難分離の不純物を上流で作り込まない設計がより重くのしかかります。 どちらも固相合成ですが、核酸は「欠損体を電荷で分ける」、ペプチドは「多様な副反応を疎水性で分ける」という違いがあり、ペプチドのほうが副反応の種類が多いぶん上流での作り込みの比重が大きくなります。

なお、ペプチドは規制上「低分子と生物学的製剤の中間」に位置づけられ、そのどちらのガイダンスからも外れやすいことから、合成ペプチド原薬の品質特性を扱う専用の考え方が整備されつつあります。低分子API全体の工程管理の発想は低分子原薬（API）の製造工程とも通じるので、あわせて押さえておくと理解が立体的になります。

まとめ

ペプチド医薬の固相合成（SPPS）は、樹脂に固定したアミノ酸へカップリングとα-アミノ基の脱保護を配列長のぶん繰り返して鎖を伸ばすプロセスです。現在の医薬品製造ではFmoc法が主流で、塩基での脱保護と酸での切り出しという直交性が扱いやすさの土台になっています。

品質の要は、各サイクルの完結度と副反応の抑制です。欠失体・エピマー体・アスパルチミド・凝集といった副生成物のうち、とくに欠失体とエピマー体は全長体と似ていて精製で除きにくく、上流での作り込みが最終純度を左右します。精製は分取逆相HPLCが主役ですが、難分離の不純物を残さないことが前提になります。

長鎖・難配列では、SPPS単独に固執せず、フラグメント縮合や液相とのハイブリッド、化学的ライゲーションといった打ち手を組み合わせるのが現実的です。同じ固相合成でも、核酸が欠損体を電荷で分けるのに対し、ペプチドは多様な副反応を疎水性で分けるという違いがある。上流の合成と下流の精製を一体で設計する視点が、安定した原薬づくりにつながります。

参考文献

• USP, Peptide Standards — 合成ペプチド治療薬の品質特性（USP <1503>）および出発物質（<1504>）に関する取り組み
• ICH Q3A, Impurities in New Drug Substances
• ICH Q11, Development and Manufacture of Drug Substances
• Behrendt R, White P, Offer J, Advances in Fmoc solid-phase peptide synthesis, J Pept Sci. 2016;22(1):4-27（総説）
• FDA, Drugs — Guidance, Compliance & Regulatory Information
• EMA, Scientific guidelines