オリゴ核酸の固相合成とは？ ホスホロアミダイト法の4工程を解説
オリゴ核酸（合成オリゴヌクレオチド）は、DNAやRNAの短い鎖を化学的に一塩基ずつつないで作ります。アンチセンスやsiRNAといった核酸医薬の原薬は、そのほとんどがこの化学合成でできています。生物由来の発酵や培養ではなく、決まった試薬を順番に流す反応の繰り返しで、狙った配列を組み上げていきます。
現在の主流はホスホロアミダイト法です。固相担体（樹脂やガラスビーズ）に最初の一塩基を固定し、そこへ次の塩基を3'側から5'側へと伸ばしていきます。1塩基を足すたびに、脱保護→カップリング→キャッピング→酸化（または硫化）という4つの工程を1サイクルとして回します。20塩基なら約20サイクル、というように、配列長のぶんだけこのサイクルを繰り返します。
固相で合成する利点は、洗浄で余分な試薬を流し落とせる点にあります。目的の鎖は担体に固定されたまま動かないため、各工程のあいだに溶媒で洗えば、過剰試薬や副生成物を除いて次へ進めます。一方で、1サイクルの取りこぼしが配列全体の純度に効いてくるため、各工程の完結度と欠損不純物の管理が品質の要になります。本稿では、この4工程サイクルと、n-1などの不純物、スケールと精製の考え方を整理します。
ホスホロアミダイト法の4工程サイクル
合成は、固相担体に固定された鎖の5'末端に、次の1塩基を足す作業の繰り返しです。1サイクルは次の4工程で構成されます。伸長方向は3'から5'で、溶液合成の生合成方向（5'→3'）とは逆になる点に注意が必要です。
脱保護（detritylation）
サイクルの入口です。伸長中の鎖の5'末端は、DMT（4,4'-ジメトキシトリチル）基で保護されています。ここへ酸（トリクロロ酢酸など）を作用させてDMT基を外し、次のカップリングに使う5'水酸基を露出させます。外れたDMTはオレンジ色を示すため、その吸光度を測ることで各サイクルのカップリング効率を間接的にモニターできます。
カップリング
露出した5'水酸基に、次の塩基のホスホロアミダイトを結合させます。アミダイトは大過剰で加え、活性化剤（テトラゾール類）で反応性を高めます。ここで亜リン酸トリエステル（P(III)）の結合ができます。反応しきらずに残った5'水酸基は、次のキャッピングで塞ぎます。
キャッピング
カップリングで反応しなかった5'水酸基を、無水酢酸などのキャッピング試薬でアセチル化して塞ぎます。塞いでおかないと、その鎖は次のサイクルで再び伸長に参加してしまい、途中で1塩基抜けた配列（欠損体）が生まれます。キャッピングはこの欠損体の発生を抑え、後で除きやすい短鎖にとどめる役割を持ちます。
酸化（または硫化）
カップリングでできた亜リン酸トリエステル（P(III)）は不安定なため、安定なリン酸トリエステル（P(V)）へ変換します。天然型のリン酸ジエステル結合を作る場合はヨウ素・水・塩基による酸化を、核酸医薬で多いホスホロチオエート結合（S化した骨格）を作る場合は硫化剤（Beaucage試薬など）による硫化を行います。 この工程で結合の化学（酸素型かイオウ型か）が決まります 。
1サイクルは脱保護→カップリング→キャッピング→酸化(硫化)の4工程。伸長は3'→5'方向で、酸化を硫化に置き換えるとホスホロチオエート骨格になります。
核酸医薬の原薬に多いホスホロチオエート型は、ヌクレアーゼ耐性の付与などを狙って骨格の酸素をイオウに置き換えたものです。合成上は酸化工程を硫化工程に差し替えて作りますが、この配列は詳しくはアンチセンス核酸の設計思想と密接に関わります。
n-1などの欠損不純物
固相合成の純度は、各サイクルのカップリング効率に強く依存します。1サイクルあたりわずかに反応が取りこぼされると、その鎖は全長より短い配列として残ります。
各カップリングで伸長しきれなかった鎖が積み重なることで、全長（n）に対して1塩基少ないn-1、2塩基少ないn-2といった欠損配列（ショートマー）が生じます。配列が長いほどサイクル数が増えるため、全長体の割合はサイクル効率の累乗で効いてきます。仮に1サイクルの効率が同じでも、塩基数が増えるほど全長の取り分は下がります。
- n-1：1塩基抜けた配列。脱保護やカップリングの不足で生じます。全長との差が1塩基しかなく、後述の精製でもっとも分離しにくい不純物です。
- n-2以下のショートマー：2塩基以上短い配列。全長との性質差が大きく、クロマトグラフィーで比較的除きやすい部類です。
- キャッピング由来の短鎖：キャッピングで途中終結させた鎖。伸長には参加しないため、除去対象として扱いやすくなります。
もっとも手強いのはn-1で、 全長体との差が1塩基しかないため分離が難しい です。だからこそ、キャッピングで欠損を短鎖側に追いやり、脱保護とカップリングを高い効率で完結させることが、上流での純度づくりの基本になります。
スケールと固相担体（CPG）
固相合成のスケールは、使う担体の量と、そこに担持できる最初の塩基の量で決まります。研究用の数nmol〜数μmolから、医薬品原薬向けの大規模まで、基本の4工程サイクルは変わりません。
担体としてよく使われるのがCPG（Controlled Pore Glass、細孔径制御ガラス）です。高純度シリカからなり、細孔径をそろえて作れるため、試薬が担体の内部まで均一に行き渡りやすいという特徴があります。細孔径は用途に応じて選び、長い配列を作るときほど大きめの細孔が使われる傾向があります。ポリスチレン系の樹脂担体が使われることもあります。
| 項目 | 内容 |
|---|---|
| 担体 | CPG（細孔径制御ガラス）／ポリスチレン系樹脂など |
| 伸長方向 | 3'末端を担体に固定し、5'側へ伸長 |
| スケール | 研究用の数nmol〜μmolから原薬向け大規模まで |
| サイクル | 脱保護→カップリング→キャッピング→酸化(硫化) |
合成が終わると、鎖を担体から切り出し、塩基や骨格の保護基を外します。この切り出しと脱保護には、濃アンモニア水を用いて加熱する条件が広く使われます（55℃前後で十数時間といった条件が一例です。配列や修飾によって条件は変わります）。切り出した粗生成物には、前述のショートマーや脱保護副生成物が混ざっているため、続いて精製に進みます。
精製：HPLCとイオン交換
粗生成物から全長体を取り出す精製では、逆相HPLCとイオン交換クロマトグラフィーが代表的な手法です。どちらも、全長体と欠損体の性質差を利用して分けます。
- イオン交換クロマトグラフィー：オリゴ核酸の骨格が持つ負電荷（リン酸基）の数の違いで分けます。塩基数が多いほど電荷が多いため、全長体と短鎖を電荷差で分離できます。分離できる鎖長には上限があり、一定より長い配列では効きにくくなります。
- 逆相HPLC：疎水性の差で分けます。合成後にDMT基を残したまま精製する「トリチルオン（DMTオン）精製」では、全長体だけがDMTの疎水性を持つため、疎水性の差を大きくして欠損体と分けやすくします。精製後にDMTを外して仕上げます。
トリチルオン精製は、長い配列で全長体と失敗配列の疎水性差を作りやすく、比較的長い鎖でも使える方法として知られます。一方で、いずれの精製でもn-1の除去は難しく、上流のサイクル効率で全長体の割合をあらかじめ高めておくことが、最終的な純度を左右します。精製と品質管理の考え方は、同じ核酸医薬でも二本鎖を扱うsiRNAの製造プロセスとも共通する部分が多いです。
精製は「全長体と欠損体の性質差」を使います。イオン交換は電荷、逆相HPLC（特にトリチルオン）は疎水性。ただしn-1は差が小さく、上流のサイクル効率での作り込みが前提になります。
まとめ
オリゴ核酸の固相ホスホロアミダイト合成は、脱保護→カップリング→キャッピング→酸化（硫化）の4工程を、配列長のぶんだけ繰り返すプロセスです。核酸医薬で多いホスホロチオエート型は、酸化を硫化に差し替えて作ります。
品質の要は、各サイクルの完結度です。取りこぼしはn-1やショートマーとして残り、とくにn-1は精製で除きにくいため、キャッピングと高効率のカップリングで上流から抑えることが基本になります。スケールはCPGなどの担体量で決まり、切り出し・脱保護を経て、イオン交換や逆相HPLC（トリチルオン精製を含む）で全長体を取り出します。上流の合成と下流の精製を一体で設計する視点が、安定した原薬づくりにつながります。
参考文献
- USP, Oligonucleotide Standards — 合成オリゴヌクレオチド治療薬の品質評価および原材料標準に関する取り組み
- ICH Q6B, Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products
- ICH Q11, Development and Manufacture of Drug Substances
- FDA, Drugs — Guidance, Compliance & Regulatory Information
- EMA, Scientific guidelines
