mRNAのdsRNAを落とす：セルロースと逆相クロマトの使い分け

Proglenth 編集部公開 2026-07-22更新 2026-10-09約6分で読めます

N1-メチルシュードウリジン（m1Ψ）を使ったmRNAなら、免疫原性は抑えられている。開発の現場でよく聞く前提ですが、2019年の実験は違う結果を出しました。m1Ψを全面的に取り込んだmRNAをマウスに投与すると、精製する前はインターフェロンα（IFN-α）が誘導され、精製したあとは誘導されなくなったのです。引き金は塩基の修飾ではなく、IVT（試験管内転写）で副生する二本鎖RNA（dsRNA）でした。

dsRNAは、目的のmRNAと同じ材料でできた「そっくりさん」で、ポリA尾部まで持っています。ポリAをつかむオリゴdTアフィニティ精製でも、エタノール沈殿でも、サイズで分けるSEC（サイズ排除クロマトグラフィー）でも落ちません。落とすには、二本鎖という構造そのものを手がかりにする精製が要ります。

開発の人には除去法の選び方、購買には担体の入手性、品質保証には落ちたことの確かめ方が関わります。dsRNAという不純物の基礎はmRNA IVTのdsRNAを除去する方法と検出に、IVTの反応条件の側の工夫はT7 IVTの収率と品質にあります。この記事は、除去の論文と実測の数字に絞ります。

引き金は修飾ではなかった ― 2011年と2019年の実験

修飾ヌクレオチドは、免疫の反応を弱めます。ただ、それだけでは足りないことを、2つの研究が示しました。

Karikóらの2011年の報告では、修飾ヌクレオシドを取り込んだmRNAでも、I型インターフェロンや炎症性サイトカインの誘導が残っていました。原因をたどると、IVTで混ざった二本鎖RNAなどの不純物でした。HPLCで精製すると、インターフェロンも炎症性サイトカインも出なくなり、初代細胞での翻訳量は10倍から1,000倍に増えました。修飾のないmRNAも、精製で翻訳は上がりましたが、サイトカインの分泌は高いままでした。

2019年のBaiersdörferらの報告は、冒頭の実験です。m1Ψを取り込んだmRNAが、精製前はマウスでIFN-αを誘導し、セルロースで精製したあとは誘導しませんでした。

修飾と精製は、役割が別です。N1-メチルシュードウリジンは、一本鎖RNAを見張るセンサーの反応を弱め、翻訳も上げます。dsRNAを見張るセンサーは別の系統で、一本鎖への修飾だけでは抑えきれません。

修飾を入れたから免疫原性は下がっている、という読みは、精製を通した後でなければ成り立ちません。

従来の精製で落ちない理由 ― 同じ塩基、同じポリA

dsRNAは、T7 RNAポリメラーゼが転写を終えた鎖の3′末端を鋳型に使い直したり、逆向きに転写したりして、二本鎖になった産物です。素材は目的物と同じヌクレオチドなので、塩基組成も分子量の範囲も、一本鎖のmRNAと重なります。

そこで精製が噛み合いません。オリゴdTは、ポリA尾部をつかむ方式です。自己プライミングで伸びた二本鎖はポリAを含んだまま二本鎖になっているので、Thermo FisherのPOROS Oligo (dT)25のような担体でも、同じように捕まります。SECは分子量の分布が重なっているため分けきれず、エタノールやリチウム塩の沈殿は、どちらも同じように沈みます。オリゴdTアフィニティを通したから安心、という読み方ができない理由です。

セルロースで落とす ― 16%エタノールで二本鎖だけが付く

実務でいちばん通りがよいのが、セルロースを使う方法です。

エタノールを含む緩衝液のなかで、dsRNAだけがセルロースに結合します。報告された条件は16%のエタノールで、一本鎖のmRNAは素通りし、二本鎖が担体に残ります。性能は、dsRNAの90%以上を除き、mRNAの回収率は65%を超えました。mRNAの長さ、コードする配列、取り込んだ修飾ヌクレオチドの種類によらず出た結果で、マイクログラムからミリグラムの量まで扱えたとされています。

担体は特殊なものではなく、カラムクロマトグラフィー用の結晶セルロースです。Sigma-AldrichのSigmacellのような製品が使われ、候補はdsRNA除去用セルロース担体で比べられます。長く標準だった担体の流通が終わった経緯と、替えたときの確認はT7 IVTの収率と品質にあります。

POINT

回収率が65%を超えるということは、裏を返せば、最大でmRNAの3分の1ほどを失うということです。dsRNAを落とす代わりに原薬が減るので、ここを軽く見ると原価の見積もりが崩れます。IVTの温度、マグネシウム、NTPの比、反応液にカオトロピック剤を加える手法など、dsRNAの発生を減らす工夫が効けば、除去の負担が下がり、回収率も上がります。除去と抑制は、どちらか一方ではなく配分の問題です。

イオン対逆相クロマトで落とす ― 分解能と運用の重さ

もう一つの手立てが、逆相での分離です。RNAは強い負電荷を持つので、そのままでは逆相の担体に保持されません。そこで、トリエチルアンモニウム酢酸のようなイオン対試薬を移動相に加えて電荷を中和し、疎水性の差で分けます。二本鎖と一本鎖では、外側に出る塩基の量も鎖の柔らかさも違うので、保持時間に差が出ます。Karikóらの精製もこの原理でした。

2025年のMolecular Therapy Nucleic Acidsの報告は、モノリス型の逆相担体（SDVB）を、mRNAとsaRNA（自己増幅型RNA）の仕上げの精製に使いました。dsRNAに加えて、対合した断片と、残っていた鋳型DNAも落ちたとされています。キャプチャ工程では落ちきらない不純物を、一段でまとめて減らせる可能性を示した報告です。細胞では導入遺伝子の発現が上がり、自然免疫の活性化は、早い時点で下がりました。saRNAでは、温度の制御がdsRNAの除去に効くことも示されています。

	セルロース	イオン対逆相
手がかり	エタノール中で二本鎖だけが付く	二本鎖と一本鎖の疎水性の差
報告された性能	dsRNA 90%以上除去、mRNA回収65%超	dsRNAに加え、対合した断片と残った鋳型DNAも除去
負担	mRNAの損失（最大で3分の1ほど）、担体の入手	有機溶媒、イオン対試薬の除去と廃棄

逆相の代償は、工程の重さです。有機溶媒を使い、イオン対試薬を後段で除く必要があり、スケールを上げるほど溶媒の調達と廃棄が効きます。同じ原理はイオン対逆相HPLCによるmRNA分析で、純度の評価にも使われます。

選ぶ軸は、分解能の高さより、回収率と、溶媒や廃棄の負担です。

落ちたかを測る ― J2抗体の守備範囲

落ちたかどうかは、J2という抗体で測ります。J2は、40塩基対以上の二本鎖RNAを、配列によらず認識します。ELISAのキットが複数のメーカーから出ていて（dsRNAのELISA）、抗体そのものはJena Bioscienceなどが扱っています。

見落としやすいのが、守備範囲です。短い二本鎖領域は、抗体に拾われません。工程の前後で数字が下がっても、短い二本鎖が残っていないとは言えません。規格に置くときは、何塩基対以上の二本鎖を見ているのかを、定義に書いておきます。

もう一点、修飾ヌクレオチドの影響があります。2026年9月に公開されたプレプリント（査読前）は、シュードウリジンやm1Ψを含むdsRNAは、抗体を使うELISAでは検出しきれないと報告しました（ニュース）。感度の高いELISAでは検出が改善したものの、修飾の種類によって左右されたとされています。m1Ψを使うmRNAでは、標準品が自社の組成に近いか確かめておく価値があります。

抗体では拾えない刺激まで含めて答えを出すのが、細胞にmRNAを入れてインターフェロンの誘導を見る系です。時間はかかりますが、工程を変えたときに効いたかを判定できるのは、こちらです。