mRNA IVTの二本鎖RNA(dsRNA)を除去する方法と検出

なぜdsRNAが問題なのか。体がこれをウイルス感染の目印として警戒する構造だからです。細胞の自然免疫センサーがdsRNAを検知すると、I型インターフェロン自然免疫の活性化で誘導される、抗ウイルス応答や炎症を担うサイトカインのこと。などの炎症性シグナルが立ち上がり、mRNAからのタンパク質翻訳も抑えられます。安全性と有効性(翻訳量)の両面で、mRNA製造で管理すべき不純物の代表格です。

除去を難しくしているのは、dsRNAが目的物と同じヌクレオチドでできた副産物だという点です。組成が近いため、単純なサイズ分離だけでは落としきれない。だからこそ、なぜdsRNAが生じるのか、どう除去するのか(セルロースクロマト・逆相HPLC・イオン対)、どう検出するのか(J2抗体を使ったドットブロットや免疫測定)、そして修飾ヌクレオシド天然の塩基に化学的な手を加えたヌクレオシドで、自然免疫センサーによる認識を弱める。との関係まで、順序立てて押さえておく価値があります。

なぜIVTでdsRNAが生じるのか

dsRNAは、IVTDNA鋳型から試験管内でRNAを合成する反応。mRNA医薬の製造に用いる。反応の副反応から生まれます。よく挙げられる経路は次のとおりです。

• 鋳型非依存の伸長⁠：RNAポリメラーゼ(実務ではT7 RNAポリメラーゼ試験管内転写(IVT)でmRNAを合成するために使う酵素や試薬類です。T7 RNAポリメラーゼやNTP、鋳型を分解するDNaseなどが含まれます。詳しく →がよく使われます)が、合成し終えた一本鎖RNAの3'末端をさらに延ばし、折り返して自己相補的な二本鎖をつくる。
• 自己プライミングRNA自身が鋳型のように働いて相補鎖が合成される副反応。二本鎖RNA(dsRNA)が生じる原因の一つです。⁠：RNA自身が鋳型のように働き、相補鎖が合成される。
• 短い中途産物⁠：途中で止まった短鎖RNAや3'側が余分に伸びた産物が、互いに、あるいは目的物と対合する。

こうした副産物どうし、または目的物との間で相補的な領域が対合すると、dsRNAができあがります。反応温度や酵素の性質、鋳型の設計しだいで生じやすさは変わる。それでも条件を詰めても完全にはなくならないというのが、現状の共通認識です。⁠dsRNAはIVTに内在する副反応から生じ、条件最適化だけでは残存を避けにくい不純物です。

dsRNAが自然免疫と翻訳に与える影響

dsRNAが問題視されるのは、体がこれをウイルスの痕跡として認識するためです。細胞質や細胞内小胞には二本鎖RNAを感知するセンサー(RIG-I様受容体細胞内で二本鎖RNAを感知する自然免疫センサーの一群。dsRNAを検知して抗ウイルス応答を立ち上げます。やTLR3など)があり、dsRNAが引き金になるとI型インターフェロンや炎症性サイトカイン細胞が放出する免疫の情報伝達物質。細胞治療では効果と安全性のリードアウトになる。の産生が始まります。

この免疫応答は、mRNAからの翻訳にも跳ね返ります。インターフェロン応答が立ち上がると翻訳を止める側の経路が働き、せっかく導入したmRNAからのタンパク質産生が下がる。dsRNAは望まない炎症を招くと同時に、目的タンパク質の発現量細胞が目的のタンパク質を作る量。低いと必要量の確保に手間がかかり、製造コストが上がる。まで削るという二重の不利益をもたらします。

実際、修飾ヌクレオシド入りのmRNAでも、精製前は自然免疫病原体を素早く感知して働く生体防御の仕組み。dsRNAをウイルスの痕跡とみなし炎症反応を起こします。を刺激し翻訳が抑えられるのに、dsRNAを取り除くと免疫刺激が消え翻訳が伸びる、という関係が報告されています。⁠dsRNAの除去は、安全性の確保と翻訳効率mRNAがリボソームによりタンパク質に翻訳される際の効率を示す指標。の底上げを同時に狙える工程です。

除去法：セルロースクロマト・逆相HPLC・イオン対

dsRNAを落とす代表的な手法を、実務での位置づけとともに整理します。いずれも共通しているのは、「二本鎖という構造の違い」を分離の手がかりにしている点です。

もともと、修飾ヌクレオシド入りmRNAから免疫刺激を消すには、分取スケールのイオン対逆相HPLC疎水性の差でペプチドやオリゴを分離する液体クロマトグラフィーのこと。が有効だと示されました。ただしHPLCは装置・溶媒・回収率の面でスケールに向きにくく、代替として、エタノール共存下でdsRNAがセルロースに吸着する性質を使うセルロース法エタノール共存下でdsRNAがセルロースに吸着する性質を使う分離法。mRNAからのdsRNA除去に用います。が広がっています。報告では、セルロース法はdsRNAを概ね9割以上除去でき、二本鎖の除去率や免疫原性薬そのものが患者の免疫応答を誘発しやすい性質。凝集体や不純物、投与経路、患者背景などが要因になる。・翻訳能の面でHPLCイオン対試薬を使い疎水性の差で分ける液体クロマト。一本鎖と二本鎖RNAの分離やdsRNA除去に使われます。に匹敵するとされています。

どの手法を選ぶかは、目的の残存基準、スケール、コスト、他の精製工程との組み合わせで決まります。⁠除去の主流は、二本鎖の構造差を使うセルロースクロマトやイオン対逆相HPLCで、大量製造では回収率とスケール適性が選定の軸になります。dsRNA除去は単独の工程ではなく、mRNA原薬の製造フロー全体の中で、他の精製ステップと役割を分け合って組み込まれます。

検出：J2抗体を使ったドットブロットと免疫測定

除去がうまくいったかを確かめるには、dsRNAを選択的に測る手段が要ります。広く使われているのが、二本鎖RNAを認識するモノクローナル抗体単一のクローンに由来し、同じ標的部位を認識する均一な抗体。J2です。J2はおおむね40塩基対以上の二本鎖RNAIVTの副生成物などで生じるRNAで、自然免疫を強く刺激するため低減と定量が求められる。を、配列や塩基組成によらず認識するとされ、dsRNA検出の基準的な試薬として位置づけられています。

代表的な測定形式を整理します。

• ドットブロットメンブレンに試料を点着し抗体で標的を検出する簡便な手法。J2抗体でdsRNAを調べる用途などに使います。⁠：メンブレンに試料を点着し、J2抗体二本鎖RNAを検出するのに使う抗体で、dsRNA不純物の評価にドットブロット等で用いる。で二本鎖RNAを検出する方法。手順が簡便で、粗IVT液から精製後のmRNAまで扱えます。既知量のdsRNA標準を並走させれば、おおよその量の見当がつきます。一方で感度や工程時間には制約があるとされます。
• ELISA抗原と抗体の結合を酵素反応による発色などで検出し、目的の物質の有無や量を測る手法です。不純物や力価の測定に広く使われます。詳しく →(免疫測定)：抗体を使った定量法で、感度・信頼性の面で優れます。工程が多段で時間を要する点は運用上の論点です。
• クロマト法による定量⁠：逆相系のHPLC/UHPLCで、製造工程中のdsRNAを定量する分析法も報告されています。

規制の観点では、mRNAワクチンの品質に関する分析手順の整備が進んでおり、残存dsRNAの試験(たとえばELISA)が品質管理項目の一つとして議論されています。⁠検出はJ2抗体を核に、ドットブロットや免疫測定、クロマト定量を用途に応じて使い分けるのが実務です。除去と検出は表裏一体で、どちらか一方だけでは工程を管理しきれません。

修飾ヌクレオシドとの関係

mRNA医薬品では、ウリジンをN1-メチルシュードウリジン(m1Ψ)などの修飾ヌクレオシドに置き換える設計が広く使われています。主目的は、RNA自体が引き起こす自然免疫刺激を弱め、翻訳と安定性を高めること。加えて、修飾ヌクレオシドの使用がIVT時のdsRNA生成そのものを減らす方向に働く、という報告もあります。塩基のスタッキング(積み重なり)が変わることで非特異的な対合が起きにくくなる、といった説明がなされています。

ただし、修飾ヌクレオシドを使えばdsRNA除去が不要になるわけではありません。修飾だけでは高用量パイプラインが求める水準までdsRNAを下げきれない場合があるとされ、酵素(T7 RNAポリメラーゼ)側の改良や精製工程が引き続き必要になります。⁠修飾ヌクレオシドはdsRNAの生成を抑える方向に働く一方、除去工程を置き換えるものではなく、両者は補い合う関係です。

なお、mRNAの働きは末端構造にも支えられており、翻訳や安定性の観点ではキャッピングなどの5'末端修飾もあわせて設計されます。dsRNA管理は、これら他の品質特性と切り離さず、原薬全体の設計の一部として扱うのが現実的です。

まとめ

IVTで副生するdsRNAは、自然免疫を刺激し翻訳を下げる不純物です。目的の一本鎖RNAと組成が近いぶん、二本鎖という構造の違いを手がかりに除去する。実務ではセルロースクロマトやイオン対逆相HPLCが中心で、大量製造では回収率とスケール適性が選定を左右します。除去の成否はJ2抗体を核としたドットブロットや免疫測定、クロマト定量で確認し、除去と検出を一体で運用する。修飾ヌクレオシドはdsRNAの生成を抑える方向に働きますが除去工程の代わりにはならず、両者を組み合わせて管理していく――これが、現時点での落ち着きどころだと言えます。

参考文献

• USP, Analytical Procedures for Quality of mRNA Vaccines and Therapeutics (Draft Guidelines)
• WHO, Evaluation of the quality, safety and efficacy of messenger RNA vaccines for the prevention of infectious diseases
• EMA, Human regulatory: quality of medicines
• Karikó K, et al. "Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA." Nucleic Acids Research (2011)