mRNA IVTの二本鎖RNA(dsRNA)を除去する方法と検出

dsRNAは、ウイルス感染の目印として体が警戒する構造です。細胞の自然免疫センサーがこれを検知すると、I型インターフェロンなどの炎症性シグナルが立ち上がり、結果としてmRNAからのタンパク質翻訳が抑えられます。つまりdsRNAは、安全性の面でも有効性(翻訳量)の面でも、mRNA製造で管理したい不純物の代表格です。

やっかいなのは、dsRNAが目的物と同じヌクレオチドでできた「そっくりさん」である点です。組成が近いぶん、単純なサイズ分離だけでは落としきれません。本稿では、なぜdsRNAが生じるのか、どう除去するのか(セルロースクロマト・逆相HPLC・イオン対)、そしてどう検出するのか(J2抗体を使ったドットブロットや免疫測定)を、修飾ヌクレオシドとの関係も含めて整理します。

なぜIVTでdsRNAが生じるのか

dsRNAは、IVT反応の副反応から生まれます。よく挙げられる経路は次のようなものです。

• 鋳型非依存の伸長：RNAポリメラーゼ(実務ではT7 RNAポリメラーゼがよく使われます)が、合成し終えた一本鎖RNAの3'末端をさらに延ばし、折り返して自己相補的な二本鎖をつくる。
• 自己プライミング：RNA自身が鋳型のように働き、相補鎖が合成される。
• 短い中途産物：途中で止まった短鎖RNAや3'側が余分に伸びた産物が、互いに、あるいは目的物と対合する。

こうした副産物どうし、または目的物との間で相補的な領域が対合すると、dsRNAができあがります。反応温度や酵素の性質、鋳型の設計しだいで生じやすさは変わりますが、条件を詰めても完全にはなくならない、というのが現状の共通認識です。 dsRNAはIVTに内在する副反応から生じ、条件最適化だけでは残存を避けにくい 不純物です。

dsRNAが自然免疫と翻訳に与える影響

dsRNAが問題視されるのは、体がこれをウイルスの痕跡として認識するためです。細胞質や細胞内小胞には、二本鎖RNAを感知するセンサー(RIG-I様受容体やTLR3など)があり、dsRNAが引き金になるとI型インターフェロンや炎症性サイトカインの産生が始まります。

この免疫応答は、mRNAからの翻訳にも跳ね返ります。インターフェロン応答が立ち上がると、翻訳を止める側の経路が働き、せっかく導入したmRNAからのタンパク質産生が下がります。つまりdsRNAは、望まない炎症を招くと同時に、目的タンパク質の発現量まで削るという二重の不利益をもたらします。

実際、修飾ヌクレオシド入りのmRNAでも、精製前は自然免疫を刺激し翻訳が抑えられるのに、dsRNAを取り除くと免疫刺激が消え翻訳が伸びる、という関係が報告されています。 dsRNAの除去は、安全性の確保と翻訳効率の底上げを同時に狙える工程 です。

除去法：セルロースクロマト・逆相HPLC・イオン対

dsRNAを落とす代表的な手法を、実務での位置づけとともに整理します。いずれも「二本鎖という構造の違い」を分離の手がかりにしています。

もともと、修飾ヌクレオシド入りmRNAから免疫刺激を消すには、分取スケールのイオン対逆相HPLCが有効だと示されました。ただしHPLCは装置・溶媒・回収率の面でスケールに向きにくく、代替として、エタノール共存下でdsRNAがセルロースに吸着する性質を使うセルロース法が広がっています。報告では、セルロース法はdsRNAを概ね9割以上除去でき、二本鎖の除去率や免疫原性・翻訳能の面でHPLCに匹敵する、とされています。

どの手法を選ぶかは、目的の残存基準、スケール、コスト、他の精製工程との組み合わせで決まります。 除去の主流は、二本鎖の構造差を使うセルロースクロマトやイオン対逆相HPLCで、大量製造では回収率とスケール適性が選定の軸 になります。dsRNA除去は単独の工程ではなく、mRNA原薬の製造フロー全体の中で、他の精製ステップと役割を分け合って組み込まれます。

検出：J2抗体を使ったドットブロットと免疫測定

除去がうまくいったかを確かめるには、dsRNAを選択的に測る手段が要ります。ここで広く使われているのが、二本鎖RNAを認識するモノクローナル抗体 J2 です。J2はおおむね40塩基対以上の二本鎖RNAを、配列や塩基組成によらず認識するとされ、dsRNA検出の基準的な試薬として位置づけられています。

代表的な測定形式を整理します。

• ドットブロット：メンブレンに試料を点着し、J2抗体で二本鎖RNAを検出する方法。手順が簡便で、粗IVT液から精製後のmRNAまで扱えます。既知量のdsRNA標準を並走させれば、おおよその量の見当がつきます。一方で感度や工程時間には制約があるとされます。
• ELISA(免疫測定)：抗体を使った定量法で、感度・信頼性の面で優れます。工程が多段で時間を要する点は運用上の論点です。
• クロマト法による定量：逆相系のHPLC/UHPLCで、製造工程中のdsRNAを定量する分析法も報告されています。

規制の観点では、mRNAワクチンの品質に関する分析手順の整備が進んでおり、残存dsRNAの試験(たとえばELISA)が品質管理項目の一つとして議論されています。 検出はJ2抗体を核に、ドットブロットや免疫測定、クロマト定量を用途に応じて使い分けるのが実務 です。除去と検出は表裏一体で、どちらか一方だけでは工程を管理しきれません。

修飾ヌクレオシドとの関係

mRNA医薬品では、ウリジンをN1-メチルシュードウリジン(m1Ψ)などの修飾ヌクレオシドに置き換える設計が広く使われています。この置換の主目的は、RNA自体が引き起こす自然免疫刺激を弱め、翻訳と安定性を高めることです。加えて、修飾ヌクレオシドの使用がIVT時のdsRNA生成そのものを減らす方向に働く、という報告もあります。塩基のスタッキング(積み重なり)が変わることで、非特異的な対合が起きにくくなる、といった説明がなされています。

ただし、修飾ヌクレオシドを使えばdsRNA除去が不要になるわけではありません。修飾だけでは高用量パイプラインが求める水準までdsRNAを下げきれない場合があるとされ、酵素(T7 RNAポリメラーゼ)側の改良や、上で述べた精製工程が引き続き必要になります。 修飾ヌクレオシドはdsRNAの生成を抑える方向に働く一方、除去工程を置き換えるものではなく、両者は補い合う関係 です。

なお、mRNAの働きは末端構造にも支えられており、翻訳や安定性の観点ではキャッピングなどの5'末端修飾もあわせて設計されます。dsRNA管理は、これら他の品質特性と切り離さず、原薬全体の設計の一部として扱うのが現実的です。

まとめ

IVTで副生するdsRNAは、自然免疫を刺激し翻訳を下げる不純物で、目的の一本鎖RNAと組成が近いぶん、二本鎖という構造の違いを手がかりに除去します。実務ではセルロースクロマトやイオン対逆相HPLCが中心で、大量製造では回収率とスケール適性が選定を左右します。除去の成否はJ2抗体を核としたドットブロットや免疫測定、クロマト定量で確認し、除去と検出を一体で運用します。修飾ヌクレオシドはdsRNAの生成を抑える方向に働きますが除去工程の代わりにはならず、両者を組み合わせて管理していく――これが、現時点での落ち着きどころだと言えます。

参考文献

• USP, Analytical Procedures for Quality of mRNA Vaccines and Therapeutics (Draft Guidelines)
• WHO, Evaluation of the quality, safety and efficacy of messenger RNA vaccines for the prevention of infectious diseases
• EMA, Human regulatory: quality of medicines
• Karikó K, et al. "Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA." Nucleic Acids Research (2011)