mRNA IVTの二本鎖RNA(dsRNA)を除去する方法と検出

核心は一点です。dsRNAがどれだけ残るかは、セルロース吸着やイオン対逆相といった除去工程の性能だけでは決まりません。むしろ効くのは、その手前にある二つの設計です。ひとつは、鋳型を線状化する制限酵素DNAの特定の塩基配列を認識して切る酵素です。クローニングやベクター作製でDNAを狙った位置で切るために使います。詳しく →の切れ味。切断点がどれだけ揃うかで、副生する量そのものが変わります。もうひとつは、TFFがそもそも何をする工程なのかという理解です。除去の工程だと誤解したまま組むと、規格に届かない原因を最後まで見つけられません。

本稿では、鋳型を線状化する酵素の選び方から、免疫応答の仕組み、TFFが担う範囲、除去と検出の考え方、修飾ヌクレオシド天然の塩基に化学的な手を加えたヌクレオシドで、自然免疫センサーによる認識を弱める。詳しく →との関係まで、工程の上流から下流に向けて整理します。

IVTがdsRNAを生む仕組み

dsRNAは、IVT反応につきまとう副反応から生まれます。反応をどれだけ詰めても、ゼロにはなりません。

T7 RNAポリメラーゼ試験管内転写(IVT)でmRNAを合成するために使う酵素や試薬類です。T7 RNAポリメラーゼやNTP、鋳型を分解するDNaseなどが含まれます。詳しく →は、転写を終えた一本鎖RNAの3′末端を鋳型として使い直すことがあります。折り返して、自己相補的な二本鎖を作る経路です。RNA自身が鋳型のように働く自己プライミングRNA自身が鋳型のように働いて相補鎖が合成される副反応。二本鎖RNA(dsRNA)が生じる原因の一つです。詳しく →も起きます。途中で止まった短い産物どうしが対合することもあります。経路は主にこの三つです。どの経路でできても、素材は目的物とまったく同じヌクレオチド核酸を構成する単量体単位で、塩基・糖・リン酸から成り、DNAやRNAの最小構成要素。詳しく →です。塩基組成も分子量の範囲も、一本鎖のmRNAと重なります。だから、サイズや組成を手がかりにした分離だけでは、dsRNAを選んで落とせません。構造で見分ける必要があります。⁠dsRNAは反応の外側から紛れ込む不純物ではなく、IVTという反応そのものが生む副産物です。

線状化酵素の切れ味とdsRNA生成量 ― 3′末端の均一性

生成量を左右する変数は、反応条件だけではありません。鋳型を線状化環状のプラスミドを制限酵素で1か所切り、直鎖にすること。詳しく →する制限酵素の切れ味も効きます。

New England BiolabsのSapI(R0569)やBspQI(R0712)は、認識配列の外側を切るType IIS酵素です。切った後にアダプター配列が残らず、鋳型をスカーレスに線状化できます。同じ系列のBsaI-HF v2(R3733)はGGTCTCを認識し、star活性(本来の認識配列以外を切ってしまう非特異的な活性)を低減しています。Takara BioもGCTCTTC認識のBspQ IをmRNA合成向けに供給していて、線状テンプレートを作る使い方は各社共通です。核酸医薬のGMP製造では、HZymes BiotechやYeasen (翌圣生物)がGMPグレード医薬品の製造品質管理基準（GMP）に適合した製造管理と品質試験のもとで製造・出荷された試薬・原料の品質区分。詳しく →のBsaI/BspQIを供給しています。Yeasenの製品は、37℃で16時間置いてもstar活性が出ないことを確認して出荷されています。ここで読み違えやすいのが、カタログの「High-Fidelity」や「star活性の低減」という表記です。これは認識配列の外を切る精度の指標であって、切断点そのものが設計どおりに揃うかとは別の話です。星型活性が低くても、切断点の3′末端がばらつけば、そこを起点に自己プライミングが起きます。⁠線状化の質を決めるのは酵素の等級ではなく、切断後の3′末端がどれだけ揃っているかです。

dsRNAが招く自然免疫と翻訳低下

dsRNAが問題になるのは、体がこれをウイルスの痕跡として警戒するからです。

細胞質や細胞内小胞には、二本鎖RNAを感知するセンサー(RIG-I様受容体やTLR3など)があります。dsRNAが引き金になると、I型インターフェロン自然免疫の活性化で誘導される、抗ウイルス応答や炎症を担うサイトカインのこと。詳しく →や炎症性サイトカイン細胞が放出する免疫の情報伝達物質。細胞治療では効果と安全性のリードアウトになる。詳しく →の産生が立ち上がります。この免疫応答は、翻訳にも跳ね返ります。インターフェロン応答が立つと翻訳を止める側の経路が働きます。せっかく導入したmRNAからのタンパク質産生が下がるのです。修飾ヌクレオシド入りのmRNAでも、精製前は自然免疫病原体を素早く感知して働く生体防御の仕組み。dsRNAをウイルスの痕跡とみなし炎症反応を起こします。詳しく →を刺激し翻訳が抑えられます。dsRNAを取り除くと免疫刺激が消え、翻訳が伸びる。

TFFの役割とdsRNAの素通り ― MWCOという壁の性質

TFFは、濃縮とバッファー交換を担う工程です。除去のための工程ではありません。

膜が分けるのは分子量であって、二本鎖か一本鎖かという構造ではありません。これが盲点です。Merckの Pellicon 3(Ultracelタイプ)はMWCO(分画分子量)を3 kDaから30 kDaまでそろえています。TMP(膜間差圧)の上限は30℃で5.5 bar(80 psig)です。Sartoriusの Sartocon/Sartocube UF(HydrosartTFF膜の素材の一種。タンパク吸着が低く洗浄性や苛性耐性に優れ、高い回収率につながる。詳しく →タイプ)はMWCOを2 kDaから300 kDaまで持ちます。上限は4 bar(58 psi)です。長鎖のmRNAとdsRNAは、どちらも数百kDa級の分子量域にいるため、数十kDaオーダーのMWCOでは両者ともまとめて保持され、濃縮されます。Pallの T-Series(Delta再生セルロース膜)は2024年に100 kDaのグレードを加えました。狙いはmRNAや自己増幅型RNA、LNPに包んだRNAの回収率向上で、dsRNAを選んで抜くための孔径ではありません。TFFカセット平らな膜を積層したカセット型のろ過ユニットで、TFF装置に取り付けて濃縮やバッファ交換に使う消耗部材です。詳しく →のメーカーに聞くべきは、公称のMWCOではなく、dsRNAに相当する分子量域でのふるい係数溶質が膜をどれだけ通り抜けるかを表す値。1なら自由に透過し、バッファ交換や濃縮の挙動を左右する。詳しく →(sieving coefficient)の実測データです。⁠TFFはdsRNAを見えなくするだけで、除去したことにはなりません⁠。

除去の主役はセルロース吸着とイオン対逆相

除去そのものは、二本鎖という構造の違いを手がかりにする方法で行います。

代表格が、Sigma-Aldrichの Sigmacellのような微結晶セルロースを使う方法です。エタノールを含む緩衝液のなかで、dsRNAだけが選択的にセルロースへ結合します。報告では、dsRNAの90%以上を除去し、mRNAの回収率は65%を超えるとされています。もう一つの手立てがイオン対逆相HPLCイオン対試薬を使い疎水性の差で分ける液体クロマト。一本鎖と二本鎖RNAの分離やdsRNA除去に使われます。詳しく →です。二本鎖と一本鎖の疎水性分子が水と親和せず、油脂や非極性溶媒と相互作用しやすい性質で、二本鎖RNAと一本鎖RNAではその程度が異なり分離の指標となる。詳しく →の差を、専用の担体カラムに充填する多孔質ビーズ。表面のリガンドと成分の相互作用差で目的物と不純物を分離する。詳しく →と有機溶媒で分けます。どちらが正しいという話ではありません。負担の中身が違うだけです。セルロースは担体が安価で拡張しやすい一方、逆相は分解能で勝りますが、有機溶媒の調達と廃棄という負担を背負います。どちらの負担を自社のスケールで背負えるかで選びます。条件や実測の数値まで踏み込んだ比較は、dsRNA除去のクロマト応用に譲ります。⁠除去法の選定は性能の優劣ではなく、回収率添加した既知量の標準物質に対して試験で実際に測定された値の割合を示す指標で、試験の正確さを表す。詳しく →とコストのどちらを優先するかという配分の問題です。

J2抗体という検出の基準 ― 検出下限の読み方

除去の成否は、抗体で確かめます。指標はJ2抗体二本鎖RNAを検出するのに使う抗体で、dsRNA不純物の評価にドットブロット等で用いる。です。

広く使われているのが、二本鎖RNAを認識するモノクローナル抗体単一のクローンに由来し、同じ標的部位を認識する均一な抗体。詳しく →、Jena Bioscienceの J2です。J2はおおむね40塩基対以上の二本鎖RNAを、配列によらず認識します。ELISA抗原と抗体の結合を酵素反応による発色などで検出し、目的の物質の有無や量を測る手法です。不純物や力価の測定に広く使われます。詳しく →化した製品も複数あり、ACROBiosystemsのキットは8.988 pg/mLまでの高感度で定量できるとされています。ここでカタログを読み違えやすいのが「検出下限」の意味です。数字が小さいほど鋭敏に見えますが、それは40塩基対DNA二本鎖において互いに水素結合で対をなすヌクレオチドの単位で、DNA断片の長さを表す基本単位として使われる。詳しく →以上の二本鎖をどこまで薄く検出できるかの下限です。それに満たない短い二本鎖領域が無いことは保証しません。

修飾ヌクレオシドとdsRNA除去の関係

修飾ヌクレオシドは万能ではありません。dsRNAの問題を解決しません。

ウリジンをN1-メチルシュードウリジン(m1Ψ治療用mRNAでウリジンの代わりに全置換して使う改変ヌクレオシドで、免疫回避と翻訳量向上を担う。詳しく →)に置き換える設計が広く使われています。RNAセンサーへの反応を弱め、翻訳と安定性を高めるためです。ただし、dsRNAを見張るセンサーは別系統です。二つは別問題です。修飾ヌクレオシドの導入がIVT時のdsRNA生成そのものをいくらか減らす、という報告もありますが、生成をゼロにはできません。修飾を入れたmRNAでも、精製前は免疫刺激を示し、精製後には示さなくなるという関係が繰り返し確かめられています。二つは足し算の関係で、どちらかが他方の代わりにはなりません。鋳型を線状化する工程そのものについては、プラスミドの線状化で切断の設計を扱っています。⁠修飾ヌクレオシドはdsRNAの生成を抑える側に働きますが、除去工程を置き換えるものではありません⁠。

決める順番

dsRNAの管理を工程として組むときは、次の順で決めます。

一番目に、鋳型を線状化する酵素を選びます。GMP医薬品を一定の品質で安全に造るために守るべき製造・品質管理の基準（適正製造規範）です。詳しく →グレードが要るのか、その等級で切断端の均一性まで確認されているのか。ここが緩いと、下流の負荷がそのぶん増えます。二番目に、TFFをどう位置づけるかを決めます。濃縮とバッファー交換のための工程であって、dsRNA除去の工程ではないという前提に立ち、除去の工程をTFFの前後どちらに置くのが原価に合うかを検討します。三番目に、除去法を選びます。セルロース吸着か、イオン対逆相か。分解能ではなく、回収率と有機溶媒の扱いで決めます。四番目に、除去後の残存基準をどの測定で置くかを決めます。J2抗体ベースのELISAなら、認識する二本鎖の長さの下限を定義に含めます。

最後に、精製後の検体で免疫応答そのものを確認します。抗体の数字が規格に入っていても、それは特定の長さ以上の二本鎖が減ったという意味しか持ちません。数字と生物の応答を突き合わせて、初めて工程が効いていると言えます。

参考文献

• USP米国で医薬品・原料・試験法の公式基準を定める公定書で、製薬用水に関する規格も収載されている。詳しく →, Analytical Procedures for Quality of mRNA Vaccines and Therapeutics (Draft Guidelines)
• WHO, Evaluation of the quality, safety and efficacy of messenger RNA vaccines for the prevention of infectious diseases
• Karikó K, Muramatsu H, Ludwig J, Weissman D. Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA, Nucleic Acids Res. 2011;39(21):e142
• Baiersdörfer M, Boros G, Muramatsu H, et al. A Facile Method for the Removal of dsRNA Contaminant from In Vitro-Transcribed mRNA, Mol Ther Nucleic Acids. 2019;15:26-35