残存プラスミド・線状DNAをエキソヌクレアーゼで消す：Plasmid-Safe等の使いどころ
なぜ「線状DNAだけ消したい」場面があるのか
mRNAや環状DNAの製造では、目的物のとなりに開いた末端をもつ直鎖状DNAの残りが不純物として出てきます。代表例が、mRNAのIVTで鋳型に使った直鎖化プラスミドの残存分。転写が終わればDNA鋳型は不要ですが、残ると残存DNAとして管理対象になり、さらに余計な転写鋳型として二本鎖RNA（dsRNA）の副生を増やす一因にもなります。
そこで、目的物は残しつつ、開放端のある直鎖DNAだけを狙って分解するという発想が出てきます。これを担うのが、末端から削るタイプの酵素（エキソヌクレアーゼDNAを端から削る分解酵素。閉端DNAは耐性を持つため、開放端の不純物を選択的に除くのに使える。）です。
エキソヌクレアーゼは開いた末端から削るため、「端があるかどうか」で効き方が変わります。開放端の直鎖DNAは分解され、両端が閉じた閉端DNAや、端の無い環状（スーパーコイル）DNAは残る——この選択性が精製の手がかりです。
Plasmid-Safe ATP依存性DNaseの選択性
代表的な酵素が、Plasmid-Safe ATP依存性DNaseATPをエネルギー源または補因子として利用し、DNAを分解するヌクレアーゼ酵素。（LGC／Lucigen）です。メーカーの製品情報によれば、この酵素はATP存在下で直鎖状の二本鎖DNAをヌクレオチド核酸を構成する単量体単位で、塩基・糖・リン酸から成り、DNAやRNAの最小構成要素。まで分解する一方、閉環状（ニックDNA鎖に入った切れ目で、多いと不完全な転写産物を生みやすい。入り・スーパーコイルを含む）二本鎖DNAには作用しないとされています。もともとはプラスミド大腸菌の中で複製・増幅させる環状DNA。核酸医薬やベクター製造の伝統的な出発材料。調製液から混入した染色体（直鎖状）DNAを除く用途で使われてきました。
この性質は、mRNA製造にもそのまま応用できます。IVT後に残った開放端の直鎖化プラスミド環状プラスミドを制限酵素で1か所切断して線状にしたDNAで、主にmRNA合成のための転写鋳型として使用される。鋳型を選択的に消し、目的のmRNAや環状のバックボーンには手を付けない、という切り分けができるためです。
ほかのエキソヌクレアーゼ
線状DNAの選択的除去には、Plasmid-Safe以外の末端依存性ヌクレアーゼ核酸を分解する酵素です。製造では培養由来の残存DNA/RNAを分解・除去して製品の純度を高める目的で使い、ベンゾナーゼが代表例です。詳しく →も使われます。
| 酵素 | 主な基質 | 特徴 |
|---|---|---|
| Plasmid-Safe ATP依存性DNase試験管内転写(IVT)でmRNAを合成するために使う酵素や試薬類です。T7 RNAポリメラーゼやNTP、鋳型を分解するDNaseなどが含まれます。詳しく → | 開放端の直鎖dsDNA | ATP依存、閉環状dsDNAは残す |
| exonuclease V大腸菌由来の複合型エキソヌクレアーゼで、直鎖状DNAの末端から強力に分解を進める酵素。（RecBCD大腸菌由来の複合型エキソヌクレアーゼで、直鎖状DNAの末端から強力に分解を進める酵素。） | 直鎖dsDNA・ssDNA二重らせん構造をとらず一本の鎖で存在するDNAで、AAVベクターのゲノムはこの形態でカプシド内に封入されている。 | 環状DNAは基本的に分解しない |
| exonuclease III大腸菌由来のExonuclease IIIは、二本鎖DNAの平滑末端または3'陥入（3'recessed）末端から3'→5'方向に一本鎖を段階的に除去するエキソヌクレアーゼである（3'突出末端には作用しにくい）。 | 開放端の直鎖dsDNA | 平滑・陥入末端の3'側から削る |
いずれも共通するのは「開いた末端を分解の入口にする」点です。裏を返せば、両端が閉じた閉端直鎖状DNA（doggybone/ceDNAAAVのITRを末端に持つ閉端直鎖状DNA。AAVの複製酵素Repの働きで複製・切り出して作る。）は、この処理を通しても分解されにくく、逆にこの耐性を利用して不純物だけを消す設計もとられます。
mRNA製造での位置づけ
mRNA原薬では、鋳型DNAmRNA製造などで生じる二本鎖RNA(dsRNA)や鋳型DNAなど、製造工程に由来する不純物の残存量を調べる試験です。詳しく →の残りは最終的にオリゴdTアフィニティー精製やDNase処理残った鋳型DNAを分解酵素DNaseで除く工程。IVT後のmRNAから不要なDNAを取り除くために行います。などで管理します。エキソヌクレアーゼによる直鎖DNAの選択分解は、これらと組み合わせて上流で鋳型を減らしておくための一手です。実際に、鋳型プラスミドの精製・処理がIVT反応での二本鎖RNAIVTの副生成物などで生じるRNAで、自然免疫を強く刺激するため低減と定量が求められる。生成を抑えるという報告もあり、鋳型側の管理が下流の品質に波及することが示されています。
なお、エキソヌクレアーゼ処理DNAを分解する酵素で残存DNAを短く切る処理。断片サイズを下げて理論的リスクを減らす。はあくまで「開放端の直鎖DNA」に効く手段で、閉環状DNAニックや切断のない共有結合による閉じた環状DNA分子で、スーパーコイルや弛緩型を含む。や目的RNAには効きません。何を消したいのか（直鎖の鋳型か、環状のバックボーンか）を見極めて、手段を選ぶことが前提になります。
