dbDNA/ceDNAをmRNAのIVT鋳型に使う：直鎖化プラスミドの代替という選択肢

mRNAのIVT鋳型を、どう用意するか

mRNAは、DNA鋳型からT7 RNAポリメラーゼ試験管内転写(IVT)でmRNAを合成するために使う酵素や試薬類です。T7 RNAポリメラーゼやNTP、鋳型を分解するDNaseなどが含まれます。詳しく →で転写して作ります（T7 in vitro転写の収率と品質）。この鋳型として最も一般的なのが、大腸菌で増やしたプラスミドDNAを制限酵素DNAの特定の塩基配列を認識して切る酵素です。クローニングやベクター作製でDNAを狙った位置で切るために使います。詳しく →で1か所切って直鎖化環状のプラスミドを制限酵素で1か所切り、直鎖にすること。したもの（プラスミド直鎖化とIVT）です。定番ですが、大腸菌発酵に伴う細菌バックボーンプラスミドに含まれる、複製起点や耐性遺伝子など目的配列以外の大腸菌由来の領域。やエンドトキシングラム陰性菌の外膜由来の発熱性物質（LPS）で、注射剤では厳しく管理し、LAL試験などで測定します。詳しく →の持ち込み、直鎖化の切れ残り管理といった手間が付いてきます。

ここで別の選択肢になるのが、⁠酵素だけで無細胞合成生きた細胞を使わず、細胞抽出液などの反応系にDNAやRNAを加えて試験管内でタンパク質を合成する手法です。詳しく →する閉端直鎖状DNA——doggybone DNA（dbDNA）やceDNAAAVのITRを末端に持つ閉端直鎖状DNA。AAVの複製酵素Repの働きで複製・切り出して作る。です。これをIVT鋳型試験管内転写でmRNAを合成する際に用いる元となるDNA分子のこと。として使えば、発酵を経ずに鋳型を用意できます。

直鎖化プラスミドとの違い

無細胞生きた細胞を使わず、試験管内の酵素反応だけで目的物を合成・増幅する方式。合成の鋳型は、配列に制限酵素サイトを設計する必要がなく、目的配列の直後で転写を止める（ラン・オフ）設計もしやすい、という運用上の利点もあります。

品質・実務での留意点

置き換えれば万事解決、というわけではありません。鋳型を何に変えても、IVTの本質的な課題は残ります。とくに、鋳型DNAmRNA製造などで生じる二本鎖RNA(dsRNA)や鋳型DNAなど、製造工程に由来する不純物の残存量を調べる試験です。詳しく →の純度製品にどれだけ目的物質だけが含まれ、不純物や変性体が少ないかを示す指標です。抗体では単量体の割合やサイズの異なる成分の量などを見ます。詳しく →は下流での二本鎖RNA（dsRNA）生成に影響するため、どの鋳型でも純度管理は必要です。転写後にはDNase処理残った鋳型DNAを分解酵素DNaseで除く工程。IVT後のmRNAから不要なDNAを取り除くために行います。などで鋳型を消し、残存DNAとして管理します。目的mRNAの回収はオリゴdTアフィニティー精製などで行い、この工程は鋳型の種類が変わっても共通です。

また、無細胞合成の鋳型を採用する際は、合成の正確さ（末端構造・目的配列の忠実度）や、スケール・コスト・供給の観点も併せて評価します。既存のプラスミド大腸菌の中で複製・増幅させる環状DNA。核酸医薬やベクター製造の伝統的な出発材料。系プロセスからの切り替えでは、mRNA-LNPの製造プロセス全体での整合も確認したうえで判断するのが実務的です。

まとめ

• mRNAのIVTDNA鋳型から試験管内でRNAを合成する反応。mRNA医薬の製造に用いる。鋳型は、直鎖化プラスミドが定番だが、無細胞合成の閉端直鎖状DNA（dbDNA/ceDNA）で置き換える選択肢がある。
• 利点は、細菌バックボーン・エンドトキシンの持ち込みを避けられること、立ち上がりが速いこと。
• ただしdsRNA管理・残存DNA製造に使った宿主細胞に由来するDNAの不純物です。安全性の観点から、精製後にどれだけ残っているかを測る試験です。詳しく →管理・目的物精製といった下流の要件は共通で残るため、鋳型変更は工程全体で評価する。

参考文献

• Cell-Free Enzymatic DNA Technology（Touchlight）
• Purification of linearized template plasmid DNA decreases double-stranded RNA formation during IVT reaction
• Optimizing a linear 'Doggybone' DNA vaccine for influenza virus