残存ヌクレアーゼのELISA測定とは？Benzonaseを定量する

その残存ヌクレアーゼを、抗体を使ってタンパク質の量として定量するのが残存ヌクレアーゼELISA工程で加えた核酸分解酵素(ヌクレアーゼ)の残存量を測るELISAです。使った酵素が製品に残っていないかを確認します。詳しく →です。「Intelli Nuclease ELISA抗原と抗体の結合を酵素反応による発色などで検出し、目的の物質の有無や量を測る手法です。不純物や力価の測定に広く使われます。詳しく →」「Benzonase ELISA」のように、添加した酵素の銘柄ごとに専用キットが用意されている点が、この分野の大きな特徴です。

なぜ残存ヌクレアーゼを測るのか

ヌクレアーゼは、細胞破砕後の液に含まれる宿主由来のDNA・RNAを短い断片まで切り刻む酵素です。残存DNAを減らしつつ粘度を下げ、ろ過やクロマトグラフィー固定相と移動相の間での物質の相互作用（分配・吸着・イオン交換など）の差を利用して、混合物中の成分を分離・精製する操作の総称。の通液性を改善する——工程上の役割は大きい。ただし酵素そのものはタンパク質であり、精製で取り切れずに製品へ微量残ることがあります。

残った酵素は目的のベクターやタンパク質ではないため、宿主細胞由来タンパク質（HCP）生産に使う細胞に由来し製品に残るタンパク質不純物。精製で除去し、残存量を管理します。に準じた工程由来不純物mRNA製造などで生じる二本鎖RNA(dsRNA)や鋳型DNAなど、製造工程に由来する不純物の残存量を調べる試験です。詳しく →として扱われます。規制上も、添加した試薬が最終製品から十分に除かれていることをデータで示す必要があります。そのため、精製の各段階や出荷前の製品で残存ヌクレアーゼバイオ医薬品製造工程で使用した、DNAやRNAを分解する酵素が製品中に微量残留したもの。が規格以下まで下がっているかを定量します。

サンドイッチELISAの仕組み

残存ヌクレアーゼELISAの多くはサンドイッチ形式抗体1に抗原を結合させ、抗体2が結合できるかで競合を判定するエピトープビニングの測定形式。をとります。まずプレートに、対象の酵素にだけ結合する捕捉抗体を固定。試料を加えると残存ヌクレアーゼが捕捉抗体に結合し、続いて酵素標識した検出抗体が上から挟み込んで発色させます。標準品力価の基準に定めた品。検体と同じアッセイで並べて測り、相対力価の基準にする。（既知濃度の同じヌクレアーゼ）で作った検量線既知濃度の標準から作る定量の基準線。qPCRでサンプル中のDNA量を読み取るのに使う。に当てはめ、残存量をタンパク質の重さ（ng/mLなど）として算出します。

ここで測っているのは「どれだけの量あるか」であって、「どれだけ働くか（活性）」ではありません。この違いは後述しますが、規格として管理しやすいタンパク量を抗体の特異性分析法において、共存する不純物・分解物・添加剤などが存在しても目的成分だけを正確に測定できる能力。で定量するのが、ELISAの役割です。

銘柄一致がなぜ肝心か

残存ヌクレアーゼELISAで最初に躓くのが、キットと標準品を添加した酵素の銘柄に合わせる、という一点です。

万能ヌクレアーゼの多くはSerratia marcescens由来の同系統エンドヌクレアーゼですが、製造元によって配列や製法にわずかな違いがあり、別々の商標で流通しています。抗体はその酵素の立体構造を認識して結合するため、A社の酵素で作られた抗体・標準品のキットでB社の酵素を測ると、認識のずれから換算に誤差が生じます。

だからこそ各社が自社ヌクレアーゼ専用のELISAを用意しています。代表的なものだけでも、MerckのBenzonase ELISA、Kerry（旧c-LEcta）のDenarase ELISA、CygnusのEndonucleaseGTP ELISA、DuoningのIntelli Nuclease ELISA、Sino BiologicalのSuperNuclease ELISA、GenScriptのBenz-Neburase ELISA、ACROBiosystemsのGENIUS Nuclease ELISAがあります。原則は「製造で添加したのと同じ銘柄のキット・標準品で測る」こと。汎用のHCP ELISAにはヌクレアーゼを標的とした抗体が含まれていないため、原理的に残存ヌクレアーゼは検出できない点も押さえておく必要があります。

活性測定との違い

残存ヌクレアーゼを評価する方法には、ELISAのほかに活性アッセイがあります。活性アッセイは基質のDNAを分解する能力が残っているかを見るもので、「酵素として機能しているか」を問います。一方ELISAは、機能の有無にかかわらず酵素タンパク質の存在量を測ります。

失活して働かなくなった酵素でも、タンパク質として残存していれば免疫原性薬そのものが患者の免疫応答を誘発しやすい性質。凝集体や不純物、投与経路、患者背景などが要因になる。などのリスクは排除できません。そのため規格管理にはタンパク量を定量できるELISAが用いられることが多く、活性アッセイは工程確認や補完として位置づけられます。両者は測定対象が異なるため、数値を直接比較できない点に注意が必要です。

キットの選び方と留意点

キット選定の出発点は、くり返しになりますが「どの銘柄のヌクレアーゼを添加したか」です。そのうえで確認すべき点は三つ——検出感度（LOD/LOQ）が規格に対して十分か、自社の試料マトリックス分析対象物が含まれる試料の背景成分（緩衝液・血清・細胞培養液など）の総称で、測定値に影響を与えうる。（バッファーや共存成分）で妨害が出ないか、スパイク回収既知量を添加して回収できるかで分析法の妥当性を確認する試験。添加回収ともいう。率が許容範囲に収まるか。DuoSetのように抗体と標準品を組み合わせて自作アッセイを構築する形式（R&D SystemsのNucA DuoSetなど）もあり、既製キットと使い分けます。

実務では、精製のどの段階でサンプリングするかも設計に含めます。ヌクレアーゼは細胞溶解後やハーベスト培養液から細胞や破片を取り除いて目的物質を含む上清を回収し、後工程に渡せる清澄な液にする工程です。詳しく →後に添加され、その後のクロマトグラフィーやTFF膜面に液を平行に流しながらろ過し、目詰まりを抑えつつ濃縮やバッファ交換を行う限外ろ過（クロスフロー）装置一式です。詳しく →で酵素も分解核酸も除かれていきます。どの工程ステップで残存量が規格を下回るかを把握しておくと、除去の確からしさを示す際の根拠が明確になります。使用する酵素そのものの選定はヌクレアーゼ（ベンゾナーゼ等）の製品ガイド、残存核酸側の管理は残存DNAとqPCRとあわせて参照すると全体像が整理しやすいはずです。各社キットの一覧は残存ヌクレアーゼELISAの製品ガイドにまとめています。

参考文献

• USP米国で医薬品・原料・試験法の公式基準を定める公定書で、製薬用水に関する規格も収載されている。, 残存宿主細胞タンパク質・工程由来不純物に関する一般試験法（General Chapters）
• ICH医薬品規制の国際調和を目的として、日米欧の規制当局と製薬業界が参加する国際的なガイドライン策定機関。, Q6B 生物薬品の規格及び試験方法の設定
• EDQM（欧州薬局方欧州医薬品品質局（EDQM）が発行する、医薬品の品質基準を定めた公定書で、署名国・加盟国の規制に法的効力を持つ。）, Ph.Eur 一般規定・関連各条
• FDA, Guidance for Industry: 生物製剤のCMC・不純物管理

残存ヌクレアーゼELISA・対象ヌクレアーゼの一次情報（メーカー公表）:

• Cygnus Technologies, EndonucleaseGTP ELISA Kit（サンドイッチ形式の残存ヌクレアーゼ定量）
• Merck (Sigma-Aldrich), Benzonase ELISA Kit III（two-siteサンドイッチによる残存Benzonase検出）
• Kerry（旧c-LEcta）, Denarase ELISA Kit（残存Denaraseの定量）
• c-LEcta (Kerry), DENARASE（Serratia marcescens由来の万能エンドヌクレアーゼ）