抗体医薬応用・分析

LC-MSによるHCP分析 ― ELISAでは見えない残留タンパク質を捉える

Proglenth 編集部公開 2026-06-10約12分で読めます

HCP（宿主細胞由来タンパク質）の管理では、長年 ELISA が中心的な役割を果たしてきました。ただしELISAが教えてくれるのは「全体でどれだけ残っているか」という総量で、「どのタンパク質が、どれだけ残っているか」という中身までは分かりません。総HCP量が規格内に収まっていても、その内訳に製品の安定性を脅かす特定の酵素が紛れていることがあり、こうした個別のリスクは総量管理だけでは見えてきません。

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その死角を埋めるのが LC-MS（液体クロマトグラフィー質量分析） です。個々のHCPを1種類ずつ同定・定量できるため、ELISAでは見落とされる残留タンパク質を名指しで捉えられます。近年は2025年に整備されたUSP <1132.1> が定量手法の考え方を整理し、ペプチドマッピングを基盤とする多属性法（MAM）的な運用とも結びついて、開発・特性解析の標準的なツールになりつつあります。

言い換えれば、ELISAが「全体でどれだけ」を測る物差しなら、LC-MSは「その中に何がいるか」を名前で答える分析です。総量が規格内でも安心しきれないのは、規格を脅かすのはたいてい総量ではなく、その一種類だからです。HCPそのものの基礎とELISAの仕組みは HCPとは？抗体医薬に残る宿主細胞由来タンパク質とELISA分析を、HCPの工程上の位置づけは抗体医薬の工程フローを参照してください。

前提のおさらい

HCPは、抗体をつくる細胞が一緒に産生する目的外のタンパク質で、ICH Q6B では「製造工程由来不純物」に分類されます。総量は HCP-ELISAキットで、中身は LC-MS で測る——この二段構えが基本です。

なぜELISAだけでは足りないのか

ELISAは、HCP全体の量を高感度かつ簡便に測れる優れた方法です。日常的なロット管理では、いまも HCP-ELISAキットを使ったイムノアッセイが基本になります。ng/mL レベルの感度を持ち、スループットも高く、ICH Q6B が想定する「高感度なイムノアッセイによる総量管理」にそのまま合致します。

ただし、ELISAには原理上の限界があります。ELISAは 抗HCP抗体 を使ってHCPを捕まえますが、これは「抗体が認識できたHCPの総量」をまとめて1つの数値として返すだけです。つまり、どの種類のHCPが、どれだけ残っているかは分かりません。さらに、抗HCP抗体が認識できないHCP（カバレッジの外にあるもの）は、そもそもシグナルを出さず見落とされます。総量が基準内に収まっていても、その中に問題のあるタンパク質が潜んでいるかどうかは、ELISAだけでは判断できないのです。

抗HCP抗体は宿主細胞のHCP調製物を免疫原に作られるポリクローナル抗体ですが、免疫原に含まれないHCPや免疫原性の低いHCPには反応しにくく、⁠カバレッジが100%になることはありません⁠。免疫原のロットや作製方法によってカバレッジが変われば、同じサンプルでも返ってくる総量が変わりうる、という構造的な弱点もあります。

POINT

ELISAが返すのは「総HCP量」という1つの数字です。中身の内訳は見えず、抗体が認識できないHCPは見落とされます。「総量は基準内」でも「危険なHCPが残っていない」とは限らない——この 解像度の差 を埋めるのがLC-MSです。

LC-MSとは何を見る分析か

LC-MS は、液体クロマトグラフィー（LC）でタンパク質やペプチドを分離し、質量分析（MS）でそれぞれの質量・配列を測ることで、サンプルに含まれるタンパク質を1種類ずつ同定・定量する分析です。ELISAが「全体でいくら」だったのに対し、LC-MSは「A というHCPが何 ppm、B というHCPが何 ppm」と 個別に見分けられる のが最大の違いです。

HCPのLC-MS分析では、サンプルをトリプシンなどで消化してペプチド断片にしてから測る ボトムアップ（ペプチドマッピング型） が主流です。製品抗体が圧倒的多数を占め、HCPは ppm（百万分の一）オーダーの極微量で共存するため、ダイナミックレンジ（濃度の幅）の広さが本質的な課題になります。製品ペプチドのシグナルに埋もれた微量HCPペプチドを検出するために、消化前の濃縮や夾雑物除去といった前処理、そして後述する取得モードの工夫が重要になります。

これにより、ELISAでは見えなかった情報が得られます。たとえば、どのHCPが精製を通り抜けて製品まで残るのか、どのHCPが抗体と一緒に動いてしまうのか。こうした個別のプロファイルが分かると、精製プロセスの改良やリスク評価に直接つなげられます。残存量そのものの管理は残存HCP分析のページでも整理しています。

DDA・DIA・PRM ― 取得モードで何が変わるか

LC-MSでHCPペプチドをどう拾うかは、質量分析計の 取得モード によって大きく変わります。代表的な3つを押さえておくと、後述するターゲット／ディスカバリーの議論が理解しやすくなります。

取得モード	仕組み	向く用途
DDA（データ依存取得）	強いシグナルのペプチドを順に選んで断片化する	探索的な同定。微量HCPは強いピークに隠れて取りこぼしやすい
DIA（データ非依存取得）	質量範囲を区切り、全ペプチドを網羅的に断片化する	網羅と再現性の両立。微量HCPの取りこぼしを減らせる
PRM / MRM（標的取得）	測りたいペプチドだけを狙って高感度に追う	既知の問題HCPを正確に定量する

DDAは「目立つものから測る」ため、製品ペプチドが大量にあるHCP分析では微量HCPが選ばれにくく、ランごとに検出されるHCPが変動しがちです。これを補うのが DIA（データ非依存取得） で、設定した質量範囲を端から順に断片化するため、シグナルの強弱に左右されず網羅的かつ再現性高くHCPを拾えます。一方、すでに監視対象のHCPが決まっているなら、そのペプチドだけを狙う PRM / MRM が最も感度・正確さに優れます。どのモードを使うかは「何を知りたいか」で決まります。

POINT

DDAは探索向きだが微量HCPを取りこぼしやすい。DIAは網羅と再現性を両立し、PRM/MRMは狙ったHCPを最高感度で定量する。⁠目的に応じて取得モードを選ぶ のがLC-MS設計の出発点です。

スパイクで「量」をどう決めるか（USP <1132.1> の考え方）

2025年に整備された **USP <1132.1>**⁠（LC-MSによる残留HCP測定に関する一般章）は、HCPをLC-MSで定量する際の考え方を整理しています。質量分析のシグナル強度はペプチドごとに大きく異なるため、シグナルをそのまま濃度に換算できません。そこで、既知量の基準物質を スパイク（添加） して、シグナルと濃度を結びつける必要があります。USP <1132.1> は、その基準の置き方として大きく3つのアプローチを示しています。

基準の置き方	感度	精度・正確さ	手間
製品タンパク質を基準にする	低め	正確さは限定的	少ない（追加試薬不要）
スパイクタンパク質を基準にする	中程度	許容できる範囲	中程度
スパイクペプチド（同位体標識）を基準にする	高い	高い（絶対定量向き）	大きい（方法開発が必要）

大まかには、⁠同位体標識したペプチドを基準にする方法が、絶対定量では最も信頼性が高い とされます。各HCPに対応する重同位体ラベル化ペプチド（SIL ペプチド）を既知量添加し、軽（試料由来）／重（標準）のシグナル比から濃度を算出する考え方で、これはMRMによるタンパク質定量の常道でもあります。ただし、対象HCPごとに標準ペプチドを用意する方法開発が必要で、測れる濃度の幅も限られます。

一方、製品タンパク質を基準にする方法（製品ペプチドのシグナルを内部基準にラフに換算する）は手軽ですが、感度や正確さは劣ります。中間に位置するのが、大腸菌由来タンパク質など既知タンパク質をスパイクして検量する方法です。⁠何を知りたいか⁠（おおまかな傾向か、特定HCPの正確な量か）によって、適した方法は変わります。

狙って測るか、広く探すか

LC-MSの測り方は、目的によって大きく2つの方向に分かれます。

ひとつは ターゲット分析 です。あらかじめ「これを測りたい」と決めた特定のHCPを、PRM / MRM で狙い撃ちして正確に定量します。問題になりやすいタンパク質が分かっている場合に強く、感度・正確さが高いのが特徴です。もうひとつは ディスカバリー（網羅）分析 です。何が含まれているかを決め打ちせず、DDAやDIAでサンプル中のHCPを幅広く探索的に検出します。「まだ気づいていないHCP」を見つけるのに向いています。

両者はトレードオフの関係にあります。狙い撃ちは正確だが見える範囲が狭く、網羅は広く探せるが個々の定量の正確さは譲ります。報告されている比較でも、網羅型の相対定量は探索目的には非常に有用な一方、狙い撃ち型ほどの正確さは出にくいとされています。だからこそ、⁠目的に応じて使い分ける、あるいは組み合わせる のが現実的です。典型的には、開発初期にディスカバリーで「何が残るか」を洗い出し、危険なHCPを特定したらターゲットに切り替えて監視する、という流れになります。

POINT

ターゲット＝狙ったHCPを正確に。ディスカバリー＝未知のHCPを広く。どちらが上というより、⁠知りたいことに合わせて選ぶ のが要点です。開発初期は網羅で洗い出し、問題HCPを特定したら標的で監視する流れが定石です。

なぜ「問題HCP」の特定が重要か

HCPは数多くの種類があり、そのすべてが等しく危険なわけではありません。問題は、⁠少量でも製品に悪影響を与える特定のHCP が紛れている場合です。

典型例が 分解酵素 です。リパーゼ（PLBL2 など）は、製剤に広く使われる界面活性剤 ポリソルベート（PS80 / PS20） を加水分解し、遊離脂肪酸の析出やタンパク質の安定性低下を招くことが報告されています。総HCP量としては数 ppm に満たない微量でも、その酵素活性が長期保存中に効いてくると、製品の安定性そのものを損なうおそれがあります。同様に、プロテアーゼは抗体を断片化し、純度低下や活性低下の原因になります。こうした不純物の分類は不純物の種類でも整理しています。

ELISAの総量管理だけでは、こうした少数の危険なHCPを見つけられないことがあります。カバレッジの外にあれば、そもそもELISAのシグナルに乗りません。LC-MS で個別に同定・定量できれば、危険なHCPを名指しで監視し、精製で確実に除けているかを工程開発の段階から確認できます。これが、総量だけでは語れないHCP管理の核心です。

ELISAとLC-MSは補完関係

重要なのは、⁠LC-MSはELISAを置き換えるものではない という点です。両者は役割が違い、組み合わせて使うことで力を発揮します。

	ELISA	LC-MS
分かること	HCPの総量	個別HCPの種類と量
得意	高感度・簡便・日常管理向き	中身の内訳・問題HCPの特定
苦手	内訳が見えない／カバレッジ外を見落とす	コスト・専門性・前処理が必要
主な使いどころ	ロットごとの規格試験	プロセス開発・特性解析・リスク評価
規制上の位置づけ	現状の総量管理の標準法	補完・カバレッジ評価・問題HCP特定

実際、ELISAに使う抗HCP抗体が「どこまで広くHCPを認識できているか」（⁠カバレッジ⁠）を確認する際にも、LC-MSが使われます。免疫原に含まれるHCPと抗体が捕捉できるHCPをLC-MSで突き合わせ、ELISAが見落とすHCPを洗い出す——つまり、ELISAの妥当性そのものをLC-MSが裏側で支えている関係です。日常管理は HCP-ELISAキットで回し、節目で LC-MS によって中身とカバレッジを確認する、という役割分担が実務的です。

MAM的運用への広がり

HCPのLC-MS分析は、それ単独の試験というより、ペプチドマッピングを基盤とする 多属性法（MAM, Multi-Attribute Method） の一部として運用される流れにあります。MAMは、一度のLC-MS測定で抗体の配列確認、翻訳後修飾（脱アミド化・酸化・C末端リジンなど）、糖鎖、そしてHCPといった複数の品質属性を同時に評価する考え方です。

同じペプチドマッピングのデータから、製品由来ペプチドで品質属性を、宿主細胞由来ペプチドでHCPを読み取れるため、HCP分析をMAMのワークフローに組み込む試みが進んでいます。さらにMAMには、想定外のピーク（新規不純物）を検出する ニューピーク検出 の考え方があり、これは未知HCPを探すディスカバリー分析と発想が共通します。HCPのLC-MS分析を、特性解析全体の中に位置づけて運用していくことが、今後の方向性です。

まとめ

ELISA は HCP の総量を測る優れた方法ですが、中身の内訳までは見えず、カバレッジ外のHCPは見落とされます。⁠LC-MS は個別のHCPを同定・定量することで、その弱点を補います。測り方は、DDA・DIA・PRM/MRM といった取得モードと、スパイクによる定量基準（USP <1132.1> の3アプローチ）、そして狙い撃ちのターゲットと網羅のディスカバリーという軸で設計します。

リパーゼによるポリソルベート分解のように、⁠少量でも危険なHCP を名指しで捉えられることが、LC-MSの本質的な価値です。ELISAとLC-MSは対立するものではなく、総量は HCP-ELISAキットで、中身は LC-MS で——⁠両面から押さえる補完関係 にあります。さらにMAM的な運用へ広げることで、HCP分析は特性解析全体の一部として機能していきます。ここに、HCP管理を一段深める鍵があります。