線状DNAとは：プラスミド由来・PCR産物・閉端の見分け方

ほぼ同じ長さの線状DNA環状ではなく両端をもつ直鎖状の形態をとるDNAの総称で、末端が開いているか閉じているかによって安定性や製造方法が異なる。詳しく →を、普通のゲルに流すと、開いた末端のものも閉じた末端のものも、ほぼ同じ位置に出ます。ところが、二本鎖をほどく変性の条件で流し直すと、開いたものは元の長さの位置に、閉じたものはその2倍ほどの位置に分かれます。ある特許の実施例に載っている結果です。

線状DNAは、見た目が同じ棒状でも、末端が開いているか閉じているかで、性質が分かれます。開いた末端は酵素に削られ、閉じた末端は削られません。カタログに「linear」としか書かれていないとき、この違いは名前からも見た目からも分からないので、見分ける手立てを知っておくと、発注や受け入れで迷いません。

「線状」には二つの軸がある ― 作り方と末端

線状DNAは、環状のプラスミドと対になる言葉で、両端をもつ直鎖状のDNA全般を指します。この中に、性質の違うものが混ざっています。押さえる軸は二つです。どう作るか、そして末端が開いているか閉じているかです。

実務で出会うのは、大きく三つです。

直鎖化環状のプラスミドを制限酵素で1か所切り、直鎖にすること。詳しく →プラスミドは、mRNAの鋳型として最も使われていて、手順が確立しているぶん、立ち上がりが早い鋳型です。ただし細菌の骨格を丸ごと含みます。PCR産物は骨格を含まず、少量の断片や鋳型を素早く用意する場面に向きます。閉端直鎖状DNAは、端を閉じる酵素を使う点が共通で、無細胞生きた細胞を使わず、試験管内の酵素反応だけで目的物を合成・増幅する方式。詳しく →の反応で作るものもあれば、昆虫細胞や大腸菌の中で作るものもあります。系統の違いは閉端直鎖状DNAとはにまとめました。

「直鎖」という見た目が同じでも、作り方と末端の状態は三つで違います。

末端の状態で何が変わるか ― 酵素が削る場所

エキソヌクレアーゼDNAを端から削る分解酵素。閉端DNAは耐性を持つため、開放端の不純物を選択的に除くのに使える。詳しく →という酵素は、DNAの遊離した末端をつかんで、端から削っていきます。つかむ場所が末端なので、末端がなければ手を出せません。

精製工程で使われるPlasmid-Safe ATP依存性DNaseATPをエネルギー源または補因子として利用し、DNAを分解するヌクレアーゼ酵素。は、この原理で、線状の二本鎖DNAを分解します。ニックDNA鎖に入った切れ目で、多いと不完全な転写産物を生みやすい。詳しく →の入った環状DNAや、閉じた環状DNA、超らせん状のDNAにはほとんど働きません。遊離末端がないからです。閉端直鎖状DNAは、棒状でも、二本の鎖が両端のヘアピンでつながっているので、つかむ末端がなく、削られにくい構造です。制限酵素で切ったプラスミドやPCR産物は、末端が開いているので、同じ酵素で削られます。

この差は、精製に使えます。目的の閉端DNAを残したまま、混ざった開放末端の不純物だけを、酵素で選んで消す設計が考えられるからです。条件の組み方はIVT後の鋳型DNAを消す記事にあります。

そのため、「環状だから安定で、直鎖だから不安定」という単純化は、閉端DNAの存在で崩れます。見るべきは形ではなく、遊離末端の有無です。

安定性を決めるのは、環状か直鎖かではなく、削られる末端があるかどうかです。

見分け方 ― 変性ゲルと酵素への抵抗性

末端が閉じているかどうかは、見た目や普通のゲルでは分かりません。見分ける手立ては二つあります。

一つは、変性ゲルです。閉じたDNAは、変性させても二本の鎖がヘアピンでつながったままなので、一本の長い環に変わります。その環は、開いたDNAがほどけてできる短い一本鎖より、ゲルの中をゆっくり進みます。冒頭で触れた特許の実施例では、プロテロメラーゼ特定の配列を切って末端をヘアピン状に閉じる酵素。doggybone DNAの末端形成に使う。詳しく →（TelN）で作った約2.4 kbの閉端DNAが、変性ゲルでおよそ5 kbの位置に出ました。開いた末端のPCR産物と、制限酵素で切ったプラスミドは、どちらも2.7 kbでした。普通のゲルでは、閉端DNAも開いたPCR産物も、ほぼ同じ位置でした。

もう一つは、エキソヌクレアーゼへの抵抗性です。末端を削る酵素で処理して、残るかどうかを見ます。必ず、開いた末端の対照（PCR産物など）を同じ条件で並べます。対照が削られて、目的のDNAが残れば、閉じていると言えます。

図をダウンロード（会員・無料）

どちらも、受け取る側が供給者に求められる資料です。閉端であることをうたうなら、変性ゲルの泳動像と酵素処理の結果は、出せる資料です。

普通のゲルでは区別できません。変性ゲルと酵素への抵抗性、二つの目で見ます。

用途と選ぶ順番 ― IVT鋳型、ワクチン、ベクター

もっとも広い用途は、mRNAのIVT鋳型です。T7 RNAポリメラーゼDNA鋳型を読み取り、対応するRNA鎖を合成する酵素。詳しく →で転写する土台として、直鎖化プラスミドも閉端DNAも使えます。ただし、閉端DNAを使うときも、転写を止める3′側のヘアピンは制限酵素で切る必要があります（dbDNA/ceDNAをIVT鋳型に使う）。鋳型の純度は下流に響きます。直鎖化したプラスミドをモノリス担体で精製してから転写すると、できたmRNAに含まれる二本鎖RNA（dsRNA）IVTで副生する二本鎖のRNA。ウイルスの目印として自然免疫を刺激し、mRNAの翻訳を下げる不純物です。が減ったという報告があります。

DNAワクチン抗原タンパク質をコードするDNAを体内に投与し、宿主細胞内で抗原を発現させて免疫応答を誘導するワクチン。詳しく →では、doggybone DNAと従来の環状プラスミドを比べた前臨床の検討があり、同等の抗体価を示しました。免疫応答の大きな差は見られていません。

線状DNAのタイプを選ぶときは、次の順で決めます。

最初に、細菌の骨格を持ち込みたくないかを確かめます。持ち込みたくないなら、大腸菌を経由する直鎖化プラスミドは外れ、PCR産物か閉端DNAに絞られます。次に、末端の安定性がどこまで要るかを見ます。保存が長い、あるいは下流で酵素を使った精製を組みたいなら、閉端DNAが有利です。そのうえで、今ある設備と手順で立ち上がれるか、挿入配列の大きさが合うか、下流の工程とそろうかを確かめます。無細胞で作る閉端DNAは、その設備と手順を新たに組む必要があります。

用途を決めるのは形そのものではなく、細菌の骨格を持ち込みたくないか、末端の安定性が要るか、という条件です。

明日から確かめられること

カタログや見積もりに「linear」とあるときは、次の点を聞いてみてください。

• 末端は開いているか、閉じているか。閉じているなら、どの酵素で閉じたものか
• 閉じていることを、変性ゲルの泳動像と、エキソヌクレアーゼへの抵抗性で示せるか
• 細菌の骨格や大腸菌由来の成分を、含むか含まないか。含むなら、残存DNAとエンドトキシンの規格はあるか
• IVT鋳型試験管内転写でmRNAを合成する際に用いる元となるDNA分子のこと。詳しく →として使うなら、鋳型の精製と、下流のdsRNAの管理はどう設計されているか
• 制限酵素の切れ残りがないことを、どう確かめているか

酵素と受託は、製品データベースのPlasmid-Safe（エキソヌクレアーゼ）、PCR用の高忠実度ポリメラーゼ、直鎖状DNA（cell-free）製造・受託で比べられます。dbDNAそのものの作り方と実績はdoggybone DNA（dbDNA）に、プラスミド側の工程はプラスミドDNAの製造工程にあります。

参考文献

• Production of closed linear DNA. US Patent 9,109,250（公開文書。TelNによる閉端DNAと開放末端DNAの、普通のゲルと変性ゲルでの泳動の比較）
• LGC, Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase（線状二本鎖DNAを分解、環状・超らせん状には作用しない）
• Martínez P, et al. Purification of linearized template plasmid DNA decreases double-stranded RNA formation during IVT reaction. Front Mol Biosci. 2023;10:1248511.（C4モノリスによる直鎖化プラスミド精製で、dsRNAが減る）
• Hyde SC, et al. Linear doggybone DNA vaccine induces similar immunological responses to conventional plasmid DNA. Hum Vaccin Immunother. 2018;14(7):1663-1672.