AAVの残留DNAとは？粒子の外は落とせて、中は落とせない理由

Proglenth 編集部公開 2026-07-22更新 2026-10-09約6分で読めます

ヌクレアーゼを十分に加え、精製を重ねても、AAVの残留DNAが思うように下がらないことがあります。酵素が届かない場所に、DNAが入っているからです。

AAVの殻（カプシド）には、目的の遺伝子のほかに、プラスミドの骨格や宿主細胞のDNAの断片が、間違って詰め込まれることがあります。ある研究では、精製したカプシドの中のDNAの0.69〜3.27%がプラスミド由来で、その98%超は、目的の遺伝子を載せたプラスミドの骨格でした。

そこで残留DNAは、粒子の外と中に分けて考えます。外は工程で落とせます。中は精製では落とせないので、入りにくくなるよう上流で設計します。

どこから来るのか ― 宿主、プラスミド、殻の中

混入するDNAは、由来で三つに分かれます。

一つ目は、産生細胞のゲノムです。三重トランスフェクションではHEK293のような細胞を使い、培養の後半には、壊れた細胞から大量のDNAが液に出ます。

二つ目は、使ったプラスミドです。導入遺伝子、カプシドとレプリカーゼ（rep/cap）、アデノウイルスのヘルパー機能と、三種類を同時に入れるので、どれも混入の候補です。とくに導入遺伝子プラスミドの骨格には、大腸菌で増やすための配列や薬剤耐性遺伝子があり、細菌由来の配列として気にされます。

三つ目が、殻の中に入ったDNAです。産生細胞のゲノム断片やプラスミドの骨格が、目的の遺伝子と一緒にカプシドに包まれます。外から加えた酵素も、クロマトグラフィーの担体も、殻の内側には届きません。

三つ目がAAVに固有の問題です。外のDNAは工程で動かせても、中のDNAは粒子ができた時点で決まっています。

10 ngをそのまま当てられない理由 ― 用量が桁違い

抗体医薬の残存DNAには、1回の投与あたり10 ng、断片は約200 bpという目安があります。出どころと読み方は宿主細胞DNAの規格に書きました。この数字はもともとワクチン用の細胞基材のガイダンスにあったもので、遺伝子治療には、それを当てはめてきた経緯があります。

AAVに当てはめにくいのは、用量が桁違いだからです。全身に投与するAAVの用量は、ゲノムコピー数で体重1 kgあたり10の13乗から14乗の桁です。10の14乗の桁なら、乳児でも、ベクターのDNAだけでミリグラムの桁になる計算です。仮にその1%が目的外のDNAでも、10マイクログラムを超え、10 ngの千倍以上です。

だから遺伝子治療では、10 ngを機械的に当てるのではなく、製品ごとのリスク評価にもとづいて、残存DNAの量と断片の長さの許容範囲を、製造者が自社で決め、その根拠を説明します。

AAVでは、10 ngを守れたかより、何が、どれだけの長さで、どこに入っているかを説明できるかが問われます。

粒子の外のDNAを落とす工程 ― 酵素、捕捉、イオン交換

外のDNAには、手段がひととおり揃っています。

最初は、ヌクレアーゼ処理です。ベンゾナーゼのような酵素で、遊離のDNAを切ります。EDTAや高い塩濃度で酵素が働かなくなる失敗があるので、条件はエンドヌクレアーゼ処理で確かめてください。切っただけでは断片は液に残ります。除くのは後ろの工程の役目です。

次が、アフィニティ捕捉です。AAVだけを樹脂に捕まえ、DNAは素通りさせて流し去ります。続く陰イオン交換による空実分離でも、負電荷の強い遊離DNAは樹脂に強く結合するので、目的の粒子とは別に外れます。限外ろ過では、小さな断片が透過側へ抜けます。

ただし、空と実を分ける工程は、殻にDNAが入っているかを見る工程です。入っているDNAが目的の遺伝子かどうかまでは、見分けにくくなります。プラスミドの骨格を詰めた粒子も、中身の入った粒子として、目的の粒子と一緒に出てきます。

AAVの精製を、工程の順に左から右へ、ヌクレアーゼ処理、アフィニティ捕捉、陰イオン交換、限外ろ過と並べ、粒子の外のDNAと中のDNAがどうなるかを2段で比べた概念図。上段の粒子の外のDNA（宿主ゲノム、プラスミド）は、工程で落とせる。ヌクレアーゼ処理は遊離のDNAを切り、断片は液に残る。アフィニティ捕捉はAAVを樹脂に捕まえ、DNAは素通りする。陰イオン交換では遊離DNAが樹脂に強く結合し、粒子とは別に外れる。限外ろ過では小さな断片が透過側へ抜ける。下段の粒子の中のDNAは、どの段でも殻の中に入ったまま粒子と一緒に進む。酵素も樹脂も殻の内側には届かないので、精製では落とせない。プラスミドの骨格を詰めた粒子も、中身の入った粒子として目的の粒子と一緒に出てくる。一番下の枠は、中のDNAは入れない設計で減らすとして、プラスミドの骨格を短くして不要な細菌由来の配列を減らすこと、三つのプラスミドの比を調整すること、プラスミドを毎回入れない安定産生細胞株という選択肢を挙げている。 — AAVの精製工程で、粒子の外のDNAと中のDNAがどう扱われるかを比べた概念図

各段でDNAがどれだけ落ちたかを測っておくと、規格を外したときに、どの工程を疑うかが決まります。

外のDNAは、工程の性能として管理できます。各段の寄与を測っておけば、値が動いたときに原因を追えます。

粒子の中のDNA ― 精製ではなく上流の設計

中のDNAに対して、精製で打てる手はほとんどありません。入れないようにするのが基本です。

プラスミドの設計では、骨格を短くして、不要な細菌由来の配列を減らします。三つのプラスミドの比も効きます。比を調整すると、空カプシドの割合が下がった例があり、プラスミド比の決め方で解説しています。配列どうしの相同性を減らす設計や、プラスミドを毎回入れない安定産生細胞株という選択肢もあります。

昆虫細胞（Sf9）とバキュロウイルスの系でも、考え方は同じです。BioMarinは、この系で作ったrAAVの残存DNAの性質を調べた結果を、学会のポスターで報告しています。

受託先やプラスミドの供給元を変えるときは、残留DNAの内訳が変わるかもしれません。何が中に入っているかは、変更のたびに取り直します。

中のDNAは精製の問題ではなく、設計の問題です。工程開発の早い段階で手を付けるほど効きます。

外と中を分けて測る

外と中は、前処理で分けます。

DNaseで処理した液を測ると、殻に守られていたDNAが分かります。処理しない液と比べると、外にあったDNAが分かります。さらに、DNaseのあとに殻を壊して中身を出せば、中に入っていた配列の種類を調べられます。DNaseが十分に働かなかったときは、外のDNAが中のDNAに数えられるので、酵素が働いた根拠を確かめます。

どの配列を測るかも決めておきます。宿主のゲノムには、反復して現れる配列を狙うと感度が出ます。HEK293のDNAを、18S rRNA遺伝子を標的に二つの長さで測る方法が報告されていて、AAVに加えたHEK293のDNAの回収は88.6〜97.9%でした。プラスミドの骨格なら薬剤耐性遺伝子、ヘルパー由来なら特徴的な配列に、それぞれ専用の系を組みます。想定していない配列を探すには、次世代シーケンサーが使われます。

PCRで測る場合は、標的がつながったまま残る配列だけが数に入ります。細かく切れたDNAは数え落とされるので、量だけでなく断片の長さも合わせて見ます（qPCRが数えるもの）。装置の使い分けはddPCRによるゲノム力価、前処理の回収率は残存DNAとは？にあります。

値が動いたとき、原因が工程か前処理かを切り分けられるように、外と中の測り方を先に決めておきます。