ddPCRによるAAVゲノム力価測定：qPCRとの違いと数字がずれる理由

自社のddPCRで測ったAAV遺伝子治療で遺伝子を運ぶウイルスベクター。血清型によって集まりやすい組織が異なる。詳しく →の力価と、受託ラボの報告値が合わない。報告書には、どちらも「ddPCRで測定」と書いてあります。差が小さいこともあれば、大きく開くこともあります。

原因は、機種の精度ではないことがほとんどです。ddPCRが「絶対定量標準曲線を参照せずに、試料中のターゲット分子の実際のコピー数を直接算出する定量方法。詳しく →」と呼ばれるのは、液滴の中の数え方についての話で、何を狙って数えたか（標的）と、数える前にどう処理したか（前処理）は含まれません。この二つが違えば、同じ機種でも数字は動きます。

ゲノム力価（vg/mLAAVベクター液1mLあたりに含まれるベクターゲノムの数です。投与量を決める基本となる力価の指標です。詳しく →）は、投与量を組み立てる計算の土台になる数字です。受託先の報告書を受け取る品質保証や購買の人も、自社の値と比べる開発の人も、機種の名前より先に、標的と前処理を見てください。

ゲノム力価が数えているもの ― 殻の中のゲノムだけ

ゲノム力価試料中のベクターゲノム（vg）の数を表す力価。実カプシドの量の目安になり、カプシド力価との比で空実比を求める。詳しく →（vg/mL）は、液1 mLの中にあるベクターゲノムの数です。

AAVの粒子は、殻（カプシドウイルスの遺伝物質を包むタンパク質の殻。AAVでは直径数十ナノメートルの正二十面体の構造をとる。詳しく →）の中に、治療用の遺伝子（ベクターゲノム）を入れた形をしています。製造では、中身の入っていない空のカプシドも一緒にできてしまいます（空カプシドと充填カプシド）。殻の総数を数える物理力価と違い、ゲノム力価が見ているのは中身の入った粒子の側です。細胞に入って働くかを見る感染力価ウイルスベクターが実際に細胞へ感染する能力を表す力価。TCID50などのアッセイで測る。詳しく →は、また別の物差しです（ウイルスベクターの力価測定）。

封筒に入った手紙の数を数える作業にたとえると分かりやすくなります。数えたいのは、封筒の中の手紙だけです。封筒の外に落ちている手紙は先に処分し、封筒を開けてから手紙を数えます。ddPCRの前処理は、この三つの動作でできています。外に落ちている手紙にあたるのが、製造で残ったプラスミド大腸菌の中で複製・増幅させる環状DNA。核酸医薬やベクター製造の伝統的な出発材料。詳しく →や宿主細胞のDNAです。

ゲノム力価は、何を狙ったか、どう前処理したか、何を基準にしたかの三つが重なった数字で、一つの絶対値として読むことはできません。

絶対定量が保証すること ― qPCRとの違い

qPCR（定量PCR）標的の配列を増幅してコピー数を定量するPCR。ベクターゲノムや導入遺伝子の分布測定に使う。詳しく →は、量の分かった標準DNAを薄めた系列と、試料の増え方を見比べて、量を読み取ります。このため、標準DNAの作り方が数字に響きます。環状のプラスミドをそのまま標準にすると、直鎖に切った標準より増え方が鈍く、同じ量でも値がずれることが報告されています。海産微細藻類の遺伝子を測った研究では、環状のほうが、増幅が一定の量に達するサイクルが2.65から4.38回遅れました。測る相手が違っても、標準の形が数字を動かすことは変わりません。

ddPCR（ドロップレットデジタルPCR）は、反応液を数多くの小さな液滴に分け、DNAが入って光った液滴と、光らなかった液滴の数から量を数えます。標準DNAを使わないので、標準による誤差は入りません。Bio-RadのQX600は液滴方式、QIAGENのQIAcuityはナノプレート方式、Stilla Technologiesのnaicaは独自のCrystal方式と、分け方は違っても、数えるという原理は同じです。

ただし、絶対定量が保証するのは、液滴の中のコピーの数え方までです。2010年のLockらの研究では、AAV2の同じ参照標準品を、世界16の施設が測りました。手順書作業の手順を定めた文書。品質システムの要素を具体化し、査察でも運用が確認される。詳しく →も試薬も配ったのに、施設間の精度と一致度は低く、こうしたばらつきが初めてまとまった形で記録されました。この標準品は、各施設が自社の内部標準を校正できるよう、ATCCに寄託されています。

qPCRが劣る、という話でもありません。参照標準品を検量線既知濃度の標準から作る定量の基準線。qPCRでサンプル中のDNA量を読み取るのに使う。詳しく →に使い、前処理を見直したqPCRで、ddPCRに近い精度と正確さが得られたという報告があります（Wangら、2020年）。

ddPCRが保証するのは液滴の計数までで、標的と前処理と標準品をそろえなければ、施設をまたいだ値は一致しません。

狙う標的 ― ITRと導入遺伝子

AAVのゲノムは、両端にITR（逆位末端反復配列AAVゲノムの両端にある逆位末端反復配列。複製とパッケージングのシグナルとして働き、この間の配列がカプシドに詰め込まれる。詳しく →）という決まった配列を持ち、その間に導入遺伝子ベクターで細胞に運んで働かせる目的の遺伝子。詳しく →が入っています。どこを増幅の標的にするかで、数えるものが変わります。

ITRは、どの構築物にも共通してあるので、一つの測定系で複数の製品を測れます。ただ、ITRは折りたたまれたヘアピンの形になりやすく、増幅されにくい弱点があります。導入遺伝子を狙えば、増幅は安定しますが、測っているのはゲノムの一部です。パッケージングの途中でできた欠けたゲノムは、標的の位置によって、数に入ったり落ちたりします。

両方を同時に測る方法もあります。Bio-Radは、ITRと目的遺伝子を別の色で同じウェルに入れて測る構成を用意しています。Furuta-Hanawaらが2019年に報告した2次元ddPCRは、完全な長さのゲノムと欠けたゲノムを見分ける方法です。

ITRを狙った値と導入遺伝子を狙った値がずれたとき、どちらかが間違っているとは限りません。欠けたゲノムを数えるかどうか、という別の量を見ているからです。

ITRと導入遺伝子で値がずれるのは、測定の誤りではなく、部分ゲノムを数えるかどうかという別の量を測っているからです。

前処理と測定条件 ― 動かすと数字が動くもの

数えたいのは、殻の中のゲノムだけです。精製後の液には、残ったプラスミドや宿主細胞のDNA（残存DNA）など、殻の外のDNAが混ざっています。これを残したまま増やすと、値が大きく出ます。

そこで、まずDNA分解酵素（DNase）で殻の外のDNAを分解します。次にタンパク質分解酵素や加熱で殻を開き、ゲノムを取り出します。取り出したゲノムは、担体のDNAと界面活性剤を入れた希釈液で薄めてから、ddPCRにかけます（Addgeneの公開プロトコル）。

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この順序は、思ったより動かせません。2024年のWangらの検証では、DNaseの処理は30分を超える時間が必要で、そのあとの熱による失活は要りませんでした。大きな差が出たのは、希釈の前に熱で殻を壊す操作で、AAVのゲノム力価が10倍を超えて下がりました。ゲノムを抽出する工程を省いた前処理のほうが、抽出ありよりばらつきが小さいという結果も出ています。複数の条件を組み合わせた手順では、試験した血清型AAVのカプシドの種類による分類。組織指向性が異なり、狙う臓器や細胞に応じて選び分けられる。詳しく →のすべてで、相対標準偏差（RSD）が5%未満でした。

ddPCRは、陽性の液滴を数えやすい濃さに薄めて測るので、希釈の誤差がそのまま値に乗ります。段階希釈の液量は、希釈計算ツールで確かめられます。

同じddPCRでも、標的、DNaseの時間、希釈と加熱の順序、機種の四つは、数字を動かします。

明日から確かめられること

受託先に聞くとき、機種の型番を尋ねても、数字が比べられるかどうかは分かりません。次の点を、報告書で確かめてください。

• 標的は、ITRか、導入遺伝子か、その両方か
• DNaseの処理は、何分行い、失活の工程はあるか
• 殻を開く操作は、希釈の前か、あとか
• 基準にした参照標準品や内部標準は何で、ロット番号は記録されているか
• 標準DNA（qPCRの場合）は、環状か、直鎖か
• 複数回、複数日に測ったときのばらつきが示されているか
• 試験法の妥当性確認が、ICH Q2(R2)分析法バリデーションのガイドライン。分析手順が妥当性を持つことを確認する枠組みを定める。詳しく →に沿って行われているか
• 受託先の値と自社の値は、同じ手順の試料で並べて測ったか

この八つに答えられない報告書は、数字だけが独り歩きします。自社と受託先の値を突き合わせる考え方は比較可能性評価に、基準にする標準品の立て方は参照標準品の設定に、手順を別の施設へ移すときの注意は分析法の移管にあります。

ゲノム力価は、殻の中身を数える指標です。殻の総数はELISA抗原と抗体の結合を酵素反応による発色などで検出し、目的の物質の有無や量を測る手法です。不純物や力価の測定に広く使われます。詳しく →などで別に測り、両者を組み合わせて充填の割合を見ます。遺伝子治療製品の品質管理原料・資材・中間体・製品を規格に照らして試験し、使ってよいか、出荷してよいかの合否を決める仕事です。GMPでは製造部門から独立させます。詳しく →の全体像は遺伝子治療の品質管理にまとめています。装置と試薬は、製品データベースのデジタルPCR、リアルタイムPCR、DNA／RNA抽出で比べられます。

参考文献

• Lock M, McGorray S, Auricchio A, et al. Characterization of a recombinant adeno-associated virus type 2 reference standard material. Hum Gene Ther. 2010;21(10):1273-1285. doi:10.1089/hum.2009.223（16施設での参照標準品の測定と施設間のばらつき、ATCCへの寄託）
• Furuta-Hanawa B, Yamaguchi T, Uchida E. Two-Dimensional Droplet Digital PCR as a Tool for Titration and Integrity Evaluation of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors. Hum Gene Ther Methods. 2019;30(4):127-136.
• Wang Y, Menon N, Shen S, Feschenko M, Bergelson S. A qPCR Method for AAV Genome Titer with ddPCR-Level of Accuracy and Precision. Mol Ther Methods Clin Dev. 2020;19:341-346.
• Wang G, Ma Q, Wei C, et al. Assessment of Key Factors Impacting Variability in AAV Vector Genome Titration by Digital PCR. Int J Mol Sci. 2024;25(10):5149.（DNase処理時間、希釈と加熱の順序、機種間のRSD）
• Addgene, AAV Titration by ddPCR（Protocol）
• Serious Overestimation in Quantitative PCR by Circular (Supercoiled) Plasmid Standard: Microalgal pcna as the Model Gene. PLoS ONE. 2010.（環状プラスミドを標準にしたときの増幅サイクルのずれ。AAVに限った研究ではない）
• ICH医薬品規制の国際調和を目的として、日米欧の規制当局と製薬業界が参加する国際的なガイドライン策定機関。詳しく → Q2(R2), Validation of Analytical Procedures