CQA別 分析法の選び方：何を測るのに、どの手法を使うか

その出発点になるのが、重要品質特性(CQA＝Critical Quality Attribute、製品の安全性や有効性に影響しうるため管理すべき品質の性質)という考え方です。抗体には純度・電荷不均一性・糖鎖・凝集・宿主細胞タンパク質医薬品を作る宿主細胞に由来するタンパク質の不純物です。安全性に関わるため、精製後の残存量を測ります。詳しく →・同一性・効力といった代表的なCQA製品の有効性や安全性に直結し、規格で管理すべき品質特性。空実比や純度、凝集体などが該当する。があり、それぞれに「これを測るならこの手法」という定番の対応があります。CQAごとの定番を早見表として押さえておけば、目の前の測定結果がどの手法に由来し、何を保証しているのかが読み解けます。

では、なぜ一つの手法では足りず、原理の異なる手法をわざわざ相補的に組み合わせるのか。その理由は次節以降で解きほぐします。個別の中身は不純物の種類、電荷バリアント、糖鎖プロファイリングの各記事もあわせてご覧ください。

そもそもCQAと分析法はなぜ結びつくのか

抗体は一つの分子でありながら、実際には少しずつ違う分子の集まりです。糖鎖の付き方、末端アミノ酸の有無、酸化や脱アミド化(タンパク質中のアミノ酸が水と反応して電荷が変わる変化)の程度が分子ごとにばらつく。これを分子不均一性糖鎖や末端アミノ酸、酸化・脱アミド化の程度が分子ごとにばらつく、抗体という製品の性質。と呼びます。この不均一性のうち、効き目や安全性に影響しうるものがCQAとして管理対象になります。

分析法は、この不均一性を「ある物差し」で切って見せる道具です。サイズという物差し、電荷という物差し、質量という物差し。物差しが変われば見える顔つきも変わる。だからこそ「何を測りたいか(CQA)」を先に決め、その物差しに合う手法を選ぶ、という順番が基本になります。

ICH Q6B生物薬品の規格・試験方法の設定の考え方を示すICHガイドライン。力価などの規格を扱う。(バイオ医薬品抗体・タンパク質・核酸など生体由来の分子を利用して製造された医薬品の総称。の規格に関する国際的なガイドライン)も、規格をつくる際に理化学的性質・純度・不純物・力価などの属性ごとに試験を組む枠組みを示しています。 分析法は結果を出す道具である前に、どのCQAを見るための物差しかで選ぶものです 。

サイズと純度：SECとCE-SDS

「純度」という言葉は広く、抗体では主にサイズの物差しで測るモノマー純度と凝集・断片の量を指すことが多いです。ここで中心になるのがSEC(Size Exclusion Chromatography＝サイズ排除クロマトグラフィー多孔質の担体を通る時間差で分子をサイズ順に分離し、抗体の凝集体や断片がどれくらい含まれるかを測る手法です。詳しく →、分子の大きさで分けて分離する方法)とCE-SDS(キャピラリー電気泳動細い管（キャピラリー）に電圧をかけ、分子の電荷やサイズの違いによる移動速度の差で成分を分離する分析法です。詳しく →、細い管の中で分子をサイズ順に流す方法)です。

SECは、水溶液のまま流して大きいものほど早く出てくる性質を使い、モノマー(単量体)・凝集体タンパク質分子どうしが結合してできた高分子量の集合体です。有効性や免疫原性に影響するため、その含量を測ります。詳しく →(会合したもの)・断片(切れたもの)を一度に量ります。凝集管理の第一線に位置する手法です。ただしカラムとの相互作用や希釈の影響を受けるため、値は条件に依存する面があります。

CE-SDSは、界面活性剤タンパク質の凝集や容器壁への吸着を防ぐため製剤へ少量加える添加剤で、細胞培養で細胞を保護する目的でも使われます。詳しく →SDSで分子を覆ってサイズだけで分ける電気泳動で、還元条件と非還元条件で流します。非還元では抗体が丸ごとの状態で純度を、還元では重鎖抗体を構成する2種類のポリペプチド鎖のうち分子量が大きい方で、抗体の基本骨格と主要な機能領域を担う。・軽鎖抗体を構成する2種類のポリペプチド鎖のうち分子量が小さい方で、重鎖と対になって抗原結合部位を形成する。に分けて断片や不完全な組み立てを見ます。 凝集はSEC分子を天然に近い条件でサイズにより分ける液体クロマトグラフィー。凝集体の主要な定量法。、断片や鎖の組み立てはCE-SDSが得意で、両者は同じ「サイズ」でも見る側面が異なります 。

凝集の詳しい測り方は不純物の種類もご参照ください。

電荷不均一性：IECとicIEF

抗体は表面の電荷にもばらつきがあります。C末端リジンの残り方、脱アミド化、シアル酸を含む糖鎖などで、本体より酸性側・塩基性側に寄った分子(電荷バリアント電荷が異なる抗体の分子種。脱アミド化などの化学的分解で生じ、品質特性として管理される。)が生まれます。これらは効力や安定性に関わりうるためCQAとして見ます。

電荷を物差しにする代表がIEC(Ion Exchange Chromatography電荷の違いで分けるイオン交換クロマト。酸性・主・塩基性ピークとして電荷バリアントの量を管理する。＝イオン交換クロマトグラフィー電荷の違いで分けるイオン交換クロマト。酸性・主・塩基性ピークとして電荷バリアントの量を管理する。、電荷の違いで分けて分離する方法)とicIEFキャピラリー内にpH勾配をつくり、タンパク質を等電点の違いで分離して全長を撮像し、電荷の不均一性を評価する手法です。詳しく →(イメージング等電点抗体全体の正味電荷がゼロになるpH。電荷の性質を表す指標で、会合や粘度に関わる。電気泳動、分子が電荷ゼロになるpHの位置で分ける方法)です。IEC電荷の違いで分けるイオン交換クロマト。酸性・主・塩基性ピークとして電荷バリアントの量を管理する。は酸性ピーク・主ピーク・塩基性ピークとして相対量を出しやすく、日常の管理に向きます。icIEFは等電点(pI)そのものを見られ、分離の解像度が高い場面があります。

どちらも「何が原因でその電荷変化が起きたか」までは直接教えてくれません。原因の特定にはペプチドマッピングタンパク質を断片に切り分け、どこがどれだけ化学変化したかを調べる分析。や質量分析分子の質量を精密に測る手法。鎖の組み合わせ違いを分子量差として捉え純度評価に使う。を重ねます。 電荷不均一性脱アミド化やC末端リジンなどで抗体分子の電荷が不均一になる現象。品質特性として管理される。はIEC/icIEFで量を管理し、原因の同定は別手法に渡す、という役割分担になります 。電荷バリアントの背景は電荷バリアントで掘り下げています。

糖鎖・同一性・一次構造：質量分析とペプチドマップ

抗体のFc領域に付く糖鎖(グリカン)は、抗体依存性細胞傷害(ADCC)などの効き目や体内での消え方に影響するためCQAになります。糖鎖プロファイルは、糖鎖を切り出して蛍光標識しHILIC(親水性相互作用クロマトグラフィー親水性の担体で極性の高い分子を分離する手法です。抗体から切り出した糖鎖のプロファイル解析などに使われます。詳しく →)で分けたり、遊離した糖鎖タンパク質に付加される糖の鎖状構造で、抗体の有効性・免疫原性などに影響する重要な品質特性。を質量分析で同定したりして見ます。詳細は糖鎖プロファイリングにまとめています。

同一性(ID)と一次構造(アミノ酸の並び)の確認では、ペプチドマッピングが中心です。抗体を酵素で短い断片に切り、LC-MS/MS(液体クロマトグラフィーと質量分析)で断片ひとつずつを読み、配列が設計どおりか、どの部位が酸化・脱アミド化しているかを部位特定で見ます。全長のまま重さを量るインタクトマス分析抗体を全長のまま質量を量り、糖鎖の付き方を含めた分子量の分布を素早く俯瞰する手法。は、糖鎖の付き方を含めた分子量の分布を素早く俯瞰するのに向きます。

近年は、ペプチドマッピングを土台に複数の品質属性を一つの質量分析法でまとめて管理する多属性法ペプチドマッピングを土台に、複数の品質属性を一つの質量分析法でまとめて管理する手法。(MAM液体クロマトと質量分析を組み合わせ、残存する宿主細胞由来タンパク質を個々に同定・定量する分析手法です。詳しく →)も広がっています。 糖鎖・同一性・翻訳後修飾タンパク質が作られた後に受ける糖鎖付加や酸化などの修飾。抗体の品質特性の比較で確認する対象になる。は、質量を物差しにする手法群が主役になります 。

不純物と効力：HCPのELISAと力価試験

ここまでは製品そのものの性質でしたが、製造由来の不純物も重要なCQAです。代表が宿主細胞タンパク質(HCP＝Host Cell Protein、製造に使う細胞に由来する不純物タンパク質)で、ELISA(抗体で目的物を捕まえて量る方法)が第一線です。ただしELISAは使う抗体が捕まえられる範囲(カバレッジ)に限界があるため、原理の異なるLC-MSを補助に使う流れが定着しています。残存宿主DNAはqPCRなどで量ります。

効力(力価、potency)は、その抗体が本来の働きをどれだけ発揮するかを測る試験で、CQAの中でも特別な位置にあります。結合を見る手法(SPR＝表面プラズモン共鳴やELISA)と、細胞を使って生物活性を見るバイオアッセイ(細胞ベース法)があり、作用機序に合わせて選びます。 効力試験は「量」ではなく「働き」を見る試験で、他の物性測定では代替できません 。

なぜ一つでは足りないのか：相補的に使う考え方

ここまで見てきたとおり、一つのCQAに一つの手法が対応するのではなく、原理の異なる手法を重ねて初めて全体像が見えます。この重ね方をオルソゴナル(直交＝物差しの向きが異なる)と呼びます。

たとえば凝集は、SECで手軽に量りつつ、SECでは壊れたり見えなかったりする大きな凝集を分析用超遠心などで裏取りします。電荷バリアントはIECで量を管理し、その中身をペプチドマップや質量分析で「脱アミド化なのかリジンなのか」まで割り出します。HCPはELISAで日常管理し、ELISAで見えないタンパク質をLC-MSで探しにいきます。

一つの手法だけに頼ると、その物差しの死角に入った品質変化を見落とします。目的を決めずに手法を並べても、手間が増えるだけです。CQAを軸に「主となる管理法」と「裏取りのオルソゴナル法」を意識して組む。それが無駄なく穴のない設計につながります。 分析法は単独の合否判定器ではなく、CQAごとに役割を分担するチームとして設計するものです 。

まとめ

• 分析法は「結果を出す道具」である前に、どのCQAを見るための物差しかで選びます。
• サイズはSECとCE-SDS、電荷はIECとicIEF、糖鎖・同一性・修飾は質量分析とペプチドマップ、HCPはELISA(＋LC-MS)、効力は細胞ベース法や結合試験、というのが定番の対応です。
• 同じ「純度」でもサイズと電荷では見えるものが違い、一つの手法だけでは死角が残ります。
• 原理の異なる手法を相補的(オルソゴナル)に重ね、主管理法と裏取りを役割分担させるのが、穴のない設計の考え方です。
• 早見表はあくまで出発点で、実際の規格は製品と工程、開発ステージによって変わります。単一の正解はありません。

参考文献

• ICH Q6B「生物薬品(バイオテクノロジー応用医薬品/生物起源由来医薬品)の規格及び試験方法の設定」 — https://database.ich.org/sites/default/files/Q6B%20Guideline.pdf
• ICH Q6A「新有効成分含有医薬品(化学薬品)の規格及び試験方法の設定」 — https://database.ich.org/sites/default/files/Q6A%20Guideline.pdf
• ICH Q5E「生物薬品の製造工程の変更に伴う同等性/同質性評価」 — https://database.ich.org/sites/default/files/Q5E_Guideline.pdf
• EMA「ICH Q6B Specifications: test procedures and acceptance criteria for biotechnological/biological products」 — https://www.ema.europa.eu/en/ich-q6b-specifications-test-procedures-acceptance-criteria-biotechnological-biological-products-scientific-guideline