電荷異性体とは？酸性・塩基性バリアントとCEX-HPLC / icIEF

抗体医薬は、ひとつの均一な分子だけからできているわけではありません。培養、精製、保存、製剤化の各段階で、脱アミド化、酸化、糖鎖の違い、C末端リジン抗体重鎖のC末端に残るリジン残基。正電荷を持ち塩基性バリアントとして現れ、切断されると相対的に酸性化する。の有無、シアル酸糖鎖の末端に付く酸性の糖。負電荷を加えるため酸性バリアントに寄与し、薬物動態にも関わる。付加、糖化など、さまざまな構造変化を受けることがあります。こうした変化は分子量をほとんど変えない場合でも、分子表面の電荷状態を変えうる。その結果、同じ抗体に見えても、酸性側に寄った分子種、主成分、塩基性側に寄った分子種として分かれて検出されます。

電荷異性体の評価でよく使われるのが、CEX-HPLC（カチオン交換クロマトグラフィー固定相と移動相の間での物質の相互作用（分配・吸着・イオン交換など）の差を利用して、混合物中の成分を分離・精製する操作の総称。）とicIEF（イメージングキャピラリー等電点電気泳動等電点の違いで成分を分離する電気泳動。抗体の電荷不均一性の評価に用いる。）です。両者はそれぞれ異なる原理で電荷の偏りを捉えており、酸性バリアントと塩基性バリアントの読み分け方も、DS / DPでの解釈の仕方も、その原理の違いを踏まえると見通しがよくなります。製造工程全体での位置づけは 抗体医薬の工程フロー もあわせてご覧ください。

電荷異性体とは何か

電荷異性体とは、同じ抗体分子を基本構造として持ちながら、電荷状態が異なる分子種のことです。

抗体医薬では、目的抗体の主成分を中心に、酸性側に寄った分子種や塩基性側に寄った分子種が存在することがあります。これらはまとめて電荷バリアント電荷が異なる抗体の分子種。脱アミド化などの化学的分解で生じ、品質特性として管理される。、チャージバリアント、または電荷異性体と呼びます。

ここで押さえておきたいのは、電荷異性体は「大きさの違い」ではなく、「電荷の違い」として見えるという点です。

SEC-HPLC多孔質の担体を通る時間差で分子をサイズ順に分離し、抗体の凝集体や断片がどれくらい含まれるかを測る手法です。詳しく →は抗体のモノマー、凝集体、断片をサイズの違いで分けます。CE-SDSSDSで処理したタンパク質をキャピラリー電気泳動で分離し、抗体などの純度や分子サイズ分布（断片・凝集）を評価する手法です。詳しく →は、SDS変性後の分子量の違いを見る。これに対し、CEX-HPLCやicIEFが見ているのは、抗体分子の電荷状態や等電点抗体全体の正味電荷がゼロになるpH。電荷の性質を表す指標で、会合や粘度に関わる。の違いです。

電荷異性体分析は純度評価と近い領域にありますが、サイズバリアント製品にどれだけ目的物質だけが含まれ、不純物や変性体が少ないかを示す指標です。抗体では単量体の割合やサイズの異なる成分の量などを見ます。詳しく →の評価とは別の軸に位置します。サイズバリアントを中心とした純度評価との関係は、次の関連記事で整理しています。

なぜ抗体医薬で電荷異性体を見るのか

抗体医薬で電荷異性体を確認する理由は、電荷状態の違いが品質特性と関係する場合があるためです。

電荷異性体は、抗体の構造変化や化学修飾を反映します。脱アミド化アスパラギンなどが変化して電荷が変わる化学的分解。特定の隣接配列で起きやすい。やシアル酸付加は酸性側のバリアントとして現れることがあり、C末端リジンの残存や一部の修飾は塩基性側のバリアントとして現れることがあります。

電荷異性体は、以下のような品質項目と関係する可能性があります。

ただし、 すべての電荷異性体が必ず問題になるわけではありません 。

酸性バリアントや塩基性バリアントが一定量存在していても、活性や安全性に大きな影響を与えない場合があります。一方、特定の修飾が抗原結合部位やFc領域に関わる場合は、活性、安定性、薬物動態投与した薬が体内で吸収・分布・代謝・排泄されていく挙動。ADCではDARが大きく影響する。などへの影響も考慮が必要です。

だからこそ、電荷異性体は「存在するかどうか」だけでなく、「何が原因で生じているのか」「活性や安定性に影響するのか」「工程でコントロールできるのか」をセットで評価します。

酸性バリアントと塩基性バリアントの違い

電荷異性体は、大きく酸性バリアント、主成分、塩基性バリアントに分けて考えます。

酸性バリアントは、主成分よりも酸性側に見える分子種です。icIEFでは主成分より低いpIを示す分子種として現れ、CEX-HPLCでは条件にもよりますが、主ピークより早く溶出するピークとして扱われることが多くあります。

塩基性バリアントは、主成分よりも塩基性側に見える分子種です。icIEFでは主成分より高いpIを示す分子種として現れ、CEX-HPLCでは主ピークより遅く溶出するピークとして扱われることが多くあります。

ただし、CEX-HPLCでの溶出順はカラム、pH、塩濃度、グラジエント塩濃度やpHを段階的・連続的に変化させ、担体に結合したタンパク質を順に溶出させる操作。条件などに依存します。一般的にカチオン交換では、酸性側の分子種は保持が弱く、塩基性側の分子種は保持が強くなる傾向があります。

「酸性バリアント」「塩基性バリアント」という名称は、⁠単にpHが酸性・塩基性という意味ではありません⁠。あくまで、抗体分子の電荷状態が主成分と比較して酸性側または塩基性側にずれているという意味です。

電荷異性体はどのように生じるのか

電荷異性体は、抗体分子に生じるさまざまな構造変化や化学修飾核酸の糖・骨格・末端に施し、安定性・結合力・免疫原性を整える改変。によって生じます。

代表的な要因として、脱アミド化、C末端リジン、糖鎖の違い、シアル酸、糖化、酸化、N末端変化、断片化主鎖が切れて分子が分かれる劣化。低分子量体（LMW）として現れ、酸性側などで進みやすい。などが挙げられます。

抗体の電荷異性体は、単一の原因だけで説明できるとは限りません。複数の修飾が重なって、酸性ピークや塩基性ピークとして現れる場合があります。

たとえば酸性バリアントには、脱アミド化、シアル酸付加、糖化、C末端リジン切断などが関係することがあります。塩基性バリアントには、C末端リジンの残存、グリシンアミド化、スクシンイミド形成などが関係することがあります。糖鎖末端のシアル酸やガラクトースの違いは電荷だけでなく糖鎖プロファイル抗体などのタンパク質に結合した糖鎖の種類や割合を調べる分析です。効果や安定性、免疫原性に影響するため構造を確認します。詳しく →そのものにも現れるため、電荷異性体分析は 糖鎖分析 などの直交的同じ対象を原理の異なる複数の手法で測り、互いに補い合って評価すること。一手法の弱点を別手法で補う。な評価と合わせて読むのが基本です。

そのため、CEX-HPLCやicIEFでピークが見えたとしても、⁠それだけで原因を断定することはできません⁠。原因を確認するには、分取したピークのLC-MS解析、ペプチドマッピングタンパク質を断片に切り分け、どこがどれだけ化学変化したかを調べる分析。、糖鎖分析などの直交原理（物差しの向き）の異なる手法を重ねて品質を評価する考え方。単一手法の死角を減らす。的な分析が必要になる場合があります。

CEX-HPLCで見る電荷バリアント

CEX-HPLCは、Cation Exchange負に帯電した担体に正電荷のタンパク質を静電的に吸着させて分離する手法。抗体のポリッシングに広く使う。 HPLCイオン対試薬を使い疎水性の差で分ける液体クロマト。一本鎖と二本鎖RNAの分離やdsRNA除去に使われます。、すなわちカチオン交換HPLCです。

カチオン交換クロマトグラフィーでは、負に帯電した固定相に正電荷を持つタンパク質が相互作用します。抗体分子の電荷状態が異なるとカラムへの保持の強さが変わり、酸性バリアント、主成分、塩基性バリアントとして分離されます。

一般的なCEX-HPLCでは、酸性バリアント、主ピーク、塩基性バリアントをピーク面積比で評価します。

CEX-HPLCの結果は、以下のような評価に使われます。

CEX-HPLCの利点は、ピーク面積比として比較的直感的に評価しやすく、分取やMS連携にも展開しやすい点です。一方、移動相クロマトグラフィーにおいて試料を運ぶ液体（または気体）で、組成や流量が分離性能に大きく影響する。条件、pH、塩濃度、グラジエント、カラム選定によって分離パターンが変わるため、⁠メソッド開発が重要になります。分離方式としては塩濃度を上げて溶出するソルトグラジエントと、移動相pHを段階的に変化させるpHグラジエントバッファーのpHを連続的に変化させながら溶出し、性質の近い成分を分けて回収する方法。があり、後者は緩衝剤の選定によって主ピークと酸性・塩基性ピークの分離を最適化しやすい場合があります。

製造工程側で電荷バリアントを能動的にコントロールしたい場合は、分析用カラムだけでなく、分取スケールの 陽イオン交換レジン（CEX） や 陰イオン交換レジン（AEX） を用いたポリッシング工程の設計が関わってきます。

icIEFで見る等電点の違い

icIEFは、imaged Capillary Isoelectric Focusingの略で、キャピラリー内でタンパク質を等電点に基づいて分離する方法です。

抗体分子はpH勾配中で自分の等電点、すなわちpIの位置に集まります。分子の電荷状態が異なればpIが変わるため、酸性バリアント、主成分、塩基性バリアントをpIの違いとして検出できます。

icIEFの特徴は、電荷バリアントをpIプロファイルとして見られることです。

CEX-HPLCが「カラムへの保持の違い」として分離するのに対し、icIEFは⁠「等電点の違い」として分離します⁠。そのため、CEX-HPLCとは別の視点で電荷異性体を確認できます。

icIEFでは、キャリアアンフォライトでpH勾配を形成し、両端に陽極液・陰極液を配置してフォーカシングします。pIマーカーを併用することで、各ピークのpIをおおよそ位置づけることが可能です。バッチ間比較、製法変更比較、バイオシミラーの類似性評価、安定性評価などで活用され、CEX-HPLCと同様に酸性ピーク、主ピーク、塩基性ピークの割合やpIシフトを確認することで、抗体の電荷状態の変化を評価します。

CEX-HPLCとicIEFは何が違うのか

CEX-HPLCとicIEFはどちらも電荷異性体を評価する分析法ですが、分離の原理が異なります。

CEX-HPLCはカラム固定相とのイオン交換相互作用の違いで分離し、icIEFは抗体分子の等電点、すなわちpIの違いで分離します。

どちらか一方が常に優れているというより、 目的によって使い分けます⁠。

CEX-HPLCは製造プロセスや規格試験で使いやすく、分取や追加解析につなげやすい方法です。icIEFはpIの違いを直接的に確認でき、電荷分布のプロファイル比較に適しています。

抗体医薬の特性解析では、CEX-HPLCとicIEFを直交的に組み合わせることで、電荷異性体の全体像をより確かに捉えられます。

電荷異性体は活性・安定性にどう関係するのか

電荷異性体は、抗体の活性や安定性に影響する場合があります。

たとえば、抗原結合部位に近い脱アミド化や酸化が起これば、結合活性に影響する可能性があります。Fc領域や糖鎖の違いは、Fc受容体結合、ADCC、CDC、薬物動態などに関係する場合があります。

一方、C末端リジンの残存のように、in vivoで速やかに処理されることが多く、必ずしも臨床的な影響が大きいとは限らないバリアントもあります。

重要なのは、電荷異性体のピークが存在すること自体ではなく、⁠そのピークがどの構造変化に由来し、品質に影響するかどうかです。

そのため、CEX-HPLCやicIEFの結果だけで判断するのではなく、必要に応じてLC-MS、ペプチドマッピング、糖鎖分析、結合活性試験、細胞ベースアッセイなどと組み合わせて評価します。糖鎖に由来する酸性バリアントの寄与を切り分けたいときは、次の関連記事も参考になります。

工程ごとに電荷異性体はどう変わるのか

電荷異性体は、製造工程や保存条件の影響を受けます。

抗体医薬の製造では、培養、精製、低pH処理、ポリッシング、UF / DF、製剤化、保存のそれぞれで、電荷バリアントのプロファイルが変化することがあります。各工程の位置づけは 抗体医薬の工程フロー で全体像を確認できます。

特にIEX工程では、電荷の違いを利用してバリアントを分離・低減することがあります。陽イオン交換レジン（CEX）や陰イオン交換レジン（AEX）の条件設計によって、酸性バリアントや塩基性バリアントの除去、主成分の回収、HCPやDNAなどの工程由来不純物の低減が検討されます。

電荷異性体分析は最終製品の確認にとどまらず、⁠工程開発やポリッシング工程の設計にもつながる分析です。

DSとDPで電荷異性体評価の意味は変わる

電荷異性体の評価は、DSとDP⁠で読み方が変わります。

DSはDrug Substance、つまり原薬です。DPはDrug Product、つまり製剤です。

DSでは、電荷異性体評価は主に培養・精製工程の結果を確認する意味を持ちます。細胞培養条件、Protein A後の状態、IEXやHICなどのポリッシング工程で、酸性・塩基性バリアントがどのように変化したかを見ます。

DPでは、電荷異性体評価は製剤としての安定性を確認する意味が強くなります。処方pH、添加剤、濃度、容器、保存温度、時間経過によって酸性ピークや塩基性ピークが増えないかを確認します。

DSでは電荷異性体をプロセスの結果として読み、DPでは保存安定性の結果として読む。同じ分析でも、サンプルの由来によって問いかけが変わります。

同じCEX-HPLCやicIEFの結果でも、DSとDPでは読み方が変わります。

DSで電荷バリアントが変化していれば、培養条件、精製条件、ポリッシング条件を確認する必要があります。DPで酸性ピークが増えていれば、処方pH、保存温度、添加剤、容器、保存期間などを確認する必要があります。

抗体医薬の電荷異性体評価では、数値だけでなく、どの段階のサンプルを、どの目的で測っているのかをあわせて読むことが重要です。

まとめ

電荷異性体とは、抗体分子の電荷状態が異なる分子種です。抗体医薬では、脱アミド化、C末端リジン、糖鎖、シアル酸、糖化、酸化などの構造変化によって、酸性バリアントや塩基性バリアントが生じることがあります。

SEC-HPLCやCE-SDSがサイズや分子量の違いを見る分析であるのに対し、CEX-HPLCやicIEFは電荷状態や等電点の違いを見ます。電荷異性体はすべてが必ず問題になるわけではありませんが、活性、安定性、製造工程、バッチ間比較、規格設定に関係する場合があるため、抗体医薬の品質評価では重要な分析項目です。

CEX-HPLCでは酸性・主成分・塩基性をピークとして、icIEFではpIプロファイルとして評価し、原因を確認するにはLC-MSやペプチドマッピング、糖鎖分析などの直交的な分析を組み合わせます。抗体医薬の電荷異性体評価は最終試験だけでなく、⁠培養、精製、ポリッシング、製剤化、保存安定性をつなぐ品質指標です。

参考文献

• ICH Q6B: Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological / Biological Products.
• EMA: Guideline on development, production, characterisation and specification for monoclonal antibodies and related products.
• USP General Chapter <1055> Biotechnology-Derived Articles—Peptide Mapping.
• USP General Chapter <1056> Biotechnology-Derived Articles—Polyacrylamide Gel Electrophoresis.
• Du Y, Walsh A, Ehrick R, Xu W, May K, Liu H. Chromatographic analysis of the acidic and basic species of recombinant monoclonal antibodies. mAbs. 2012.
• Khawli LA, et al. Charge variants in IgG1: Isolation, characterization, in vitro binding properties and pharmacokinetics in rats. mAbs. 2010.
• Liu YD, van Enk JZ, Flynn GC. Human antibody Fc deamidation in vivo. Biologicals. 2009.