AAVベクターの製造工程とは？1回の培養で数人分しか作れない理由

AAVベクターの製造工程とは、治療用の遺伝子をAAV（アデノ随伴ウイルス）遺伝子治療で広く使うウイルスベクター。宿主ゲノムに組み込まれにくく、導入遺伝子を長く発現しうる。詳しく →のカプシドに詰めた粒子を細胞に作らせ、精製して注射できる液にするまでの流れです。工程を組む人、受託先を選ぶ人、品質の規格を決める人の仕事に直に関わります。

ただし、抗体医薬ほど工程の型は固まっていません。全身に投与する製品では、大きな培養槽を1回回しても、届けられるのは数人分にとどまります。

この記事では、細胞に何をさせているのか、量がどこで削られるのか、中身の無いカプシドがなぜ残るのか、できた液を何で確かめるのかを順に説明します。

1. 抗体との違い：AAVベクターは、細胞に何を組み立てさせて作るのか？

細胞の中で治療用の遺伝子とカプシドを組み立てさせ、できた粒子を回収して精製します。 AAVベクターアデノ随伴ウイルスを改変して治療用遺伝子を細胞へ運ぶために用いる、非病原性の遺伝子導入用ウイルス粒子。詳しく →は、このカプシドに遺伝子を詰めて患者の細胞へ届ける運び屋です。

違いは、細胞が何を作るかにあります。抗体なら細胞が薬そのものを培養液へ出します。AAV遺伝子治療で遺伝子を運ぶウイルスベクター。血清型によって集まりやすい組織が異なる。詳しく →ではカプシドと遺伝子を別々に作らせて中で組み立てさせるので、遺伝子の入っていない粒子（エンプティカプシド）も一緒にできてしまいます。

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いちばん標準的な作り方では、ヒト胎児腎由来の細胞（HEK293）に3種類のプラスミド（細胞に遺伝子を入れるための環状のDNA）を入れます。治療用の遺伝子、カプシドと詰め込みの遺伝子、複製を助ける遺伝子。これを3つに分けておくのは、野生型のウイルスが再生する確率を下げるためです。この操作をトリプルトランスフェクションAAV製造で、必要な3種類のプラスミドを同時に細胞へ導入してベクターを作らせる手法です。ウイルスを使わず遺伝子だけで産生します。詳しく →と呼びます（比の決め方）。

承認品でも、作り方は1つではありません。乳児の脊髄性筋萎縮症に使うオナセムノゲン アベパルボベクはこのHEK293の方式です。一方、成人の血友病Aに使うバロクトコジン ロキサパルボベクは、昆虫細胞にバキュロウイルス昆虫細胞に感染するウイルス。AAV遺伝子を組み込んでSf9を感染させ、ベクターを産生させる。詳しく →で遺伝子を運ばせる方式をとっています。

同じAAVでも、作らせる系が違えば回収の方法も、除かなければならない不純物も変わります。では、系が決まれば必要な量は作れるのでしょうか。

2. 収率が患者数を決める：培養槽を1回回しても、なぜ数人分にしかならないのか？

1人に投与する粒子の数が、培養で作れる数に対して多すぎるからです。 承認されている全身投与の製品の多くは、体重1 kgあたり10¹³から10¹⁴ vg（遺伝子を持つ粒子の数）の桁で投与されます。

オナセムノゲン アベパルボベクなら、体重1 kgあたり1.1×10¹⁴ vgを1回で投与し、体重10 kgの子どもで約10¹⁵ vgに達します。報告されている産生量の上限近くを仮定しても、⁠200 Lの培養槽を1回回して精製まで終えたときに残るのは、数人分です。眼や中枢に直接入れる製品なら、要る量の桁は下がります。

量が削られる場所は、1か所ではありません。

• 培養⁠：細胞を濃くしても総量は比例しません。密度を上げると細胞あたりの効率が落ちるため、ふつうは密度が低めのうちに遺伝子を入れます。
• 回収⁠：カプシドの型（血清型AAVのカプシドの種類による分類。組織指向性が異なり、狙う臓器や細胞に応じて選び分けられる。詳しく →）がAAV2なら細胞の中にとどまるため、細胞を溶かして中身を出します。AAV8やAAV9は培養液へ出やすく、上清を扱えます。
• 清澄化培養液から細胞や破片を取り除いて目的物質を含む上清を回収し、後工程に渡せる清澄な液にする工程です。詳しく →⁠：細胞の破片をデプスフィルターで落とす段階で、直径約26 nmのカプシドもろ材に捕まります。
• エンプティとフルの分離⁠：境目の画分を捨てるため、損失がとくに大きい段階です。

抗体医薬なら収率の数ポイントの差で済む話が、AAVでは治療できる患者の人数に直に効いてきます。合計の収率だけを見ても、改善する場所は分かりません。工程ごとの回収率を並べ、いちばん失っている段階を探します。

3. 重要：エンプティカプシドは、なぜアフィニティ捕捉では減らないのか？

担体がつかむのはカプシドの表面で、中身に遺伝子が入っているかどうかを見分けないからです。 エンプティカプシドは遺伝子を運べないのに、投与する粒子の量だけを増やします。

最初のクロマトグラフィーは、カプシドの表面に結合する担体で粒子を捕まえるアフィニティ捕捉です。抗体精製のProtein A抗体に特異的に結合するProtein Aを担体に固定し、抗体だけを選択的に捕まえて精製する手法です。抗体医薬の最初の精製工程として定番になっています。詳しく →に近い役で、一段で宿主由来の不純物の大半が落ちます。⁠不純物は落ちても、エンプティとフルの比はほとんど動きません。

では、この工程は要らないのか。そうではありません。エンプティとフルを分ける手立ては、不純物が多いままの液では精度が出ないからです。アフィニティ捕捉標的に特異的に結合する担体で目的物だけをつかまえる最初の捕捉工程。AAVでは幅広い血清型に効く樹脂や血清型特異的な樹脂を使う。詳しく →は比を変える工程ではなく、次の分離を成り立たせるために液をきれいにする工程です。溶出は低いpHで行い、カプシドは酸性で不安定なので、中和するまでの時間も手順に書いておきます。

比を動かせるのは、次の2つです。

• 陰イオン交換⁠：遺伝子が入ると粒子の表面の電荷がわずかに変わる差で分けます。装置とレジンクロマトグラフィーで目的物や不純物を結合させる粒子状の充填材。精製モードごとに使い分ける。詳しく →で回せるため、製造では標準的な選択肢です（陰イオン交換による空・充填分離）。
• 超遠心高速回転で粒子を沈めて濃縮する方法。濃縮力と純度に優れるが、扱える体積が限られスケールに壁がある。詳しく →⁠：遺伝子が入ると粒子が重くなる差（密度の差）で分けます。精度は高い一方、大きな規模には向きません。

どちらでも、境目の画分をどこで切るかの判断は残ります。純度を取れば収率が落ち、収率を取ればエンプティが残る。この綱引きは避けられません。

エンプティカプシドの管理は、分離のレジンを選ぶ話に閉じません。培養の条件を決める段階から始まっています。では、その比はどうやって数字にするのでしょうか。

4. 測定法と標準品をそろえないと比べられない：できた液は、何で確かめるのか？

遺伝子の量、カプシドの量、エンプティとフルの比、残った不純物、はたらきを、それぞれ別の試験で確かめます。 仕上げでは、タンジェンシャルフローろ過（TFF）で濃縮して製剤のバッファに置き換え、滅菌フィルターを通します。

ここで、孔径フィルター膜に存在する細孔の公称上の大きさを示す値で、保持できる粒子・微生物の最小サイズの目安となる指標（ただし実際の保持性能はバクテリアチャレンジ試験で実証される）。詳しく →0.2 µmに対してカプシドは約26 nm。⁠滅菌ろ過は微生物を除く工程で、ウイルスは素通りします。

確かめる項目は、次のように分かれます。

• 量と比⁠：遺伝子の量、カプシドの量、エンプティとフルの比を測ります。
• 残った不純物⁠：残存DNA、残存プラスミド、残存ヌクレアーゼバイオ医薬品製造工程で使用した、DNAやRNAを分解する酵素が製品中に微量残留したもの。詳しく →、宿主細胞由来タンパク質（HCP）を測ります。
• はたらき⁠：細胞に感染して遺伝子が働くかを、感染性や発現の力価で測ります。

比の基準になるのは、分析超遠心遠心中の試料の沈み方を光で測り、分子の大きさや会合状態を調べる分析装置です。純度や凝集の評価に使います。詳しく →（AUC：粒子が沈む速さの違いから重さを見る方法）です。ただ、1回の測定に6時間ほどかかるという報告があり、試料も多く要ります。そこで工程の管理には、数分で測れる質量フォトメトリーなどを併せて使う例があります。

力価はさらに厄介です。施設ごとに測り方が違うと、数字がそろいません。業界は米国の生物資源の供給機関ATCCが配るAAV2とAAV8の標準品（VR-1616、VR-1816）を共通の物差しにしていますが、AAV8の標準品を3施設で測った感染価ベクターが実際に細胞へ入り遺伝子を発現させられる、機能を持つ粒子の数を測る指標。ゲノム力価との比が質の目安になる。詳しく →でも、ばらつきが平均値より大きく出ています。

規格書に並んだ数字は、測定法と標準品をそろえて初めて比べられます。受託先の値と自社の試験の値が合わないとき、製法を疑うのは後回しです。まず同じ標準品で両方を測り直します。

5. 作らせる系と血清型から、受託先に何を聞くのか？

最初に確かめるのは、どの系で作らせるかと、どのカプシドの型（血清型）かです。 この2つで、回収の方法も、担体の選び方も、残る不純物も変わります。

• 作らせる系と血清型⁠：HEK293ヒト胎児腎由来の細胞株。アデノウイルスのE1機能を持ち、AAV産生の三重トランスフェクションで広く使われる。詳しく →に3種類のプラスミドを入れる系か、昆虫細胞とバキュロウイルスの系か。血清型が細胞の中に残る型か、培養液へ出る型かも確かめる。
• 資材の納期⁠：3種類のプラスミドとトランスフェクション培養細胞に外来の核酸を導入する操作。ウイルスベクターの一過性の産生などに用いられる。詳しく →試薬が、GMPグレード医薬品の製造品質管理基準（GMP）に適合した製造管理と品質試験のもとで製造・出荷された試薬・原料の品質区分。詳しく →でいつ届くか。プラスミド大腸菌の中で複製・増幅させる環状DNA。核酸医薬やベクター製造の伝統的な出発材料。詳しく →の納期が日程を決めることがある。
• 捕捉の担体⁠：その血清型に結合した実績があるか。低いpHで溶出したあと、中和までの時間に上限を決めているか。
• 分離の方式と比の測り方⁠：陰イオン交換か超遠心か、規格にするエンプティとフルの比、その比をAUCで測るのか別の方法で測るのかを、規格書で確かめる。
• 工程ごとの回収率⁠：回収・清澄化・捕捉・分離の段階ごとの回収率と合計を出してもらう。どこで一番失っているかが分かれば、改善の当たりが付く。
• 滅菌ろ過と力価の物差しの共有⁠：滅菌フィルターはウイルスを除かないこと、力価の標準品を受託先とそろえる必要があることを、品質と開発の両方で確かめておく。

購買や営業の立場なら、「どの血清型を、どの方式で、どの規模まで作った実績がありますか」と聞くところから始めるとよいでしょう。系と血清型、それに回収率の答えが同時に返ってきます。

受託先の比べ方はウイルスベクターの受託製造先の選び方、分離のレジンは陰イオン交換レジンとメンブレンクロマトグラフィーで比べられます。不純物と安全性の関係は製造の不純物と肝毒性、工程全体の図はアデノ随伴ウイルス（AAV）の工程フローにあります。

参考文献

• FDA, Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy INDs
• EMA, Zolgensma EPAR Product Information（1.1×10¹⁴ vg/kg、2.0×10¹³ vg/mLAAVベクター液1mLあたりに含まれるベクターゲノムの数です。投与量を決める基本となる力価の指標です。詳しく →）
• Merck, Bioprocessing and Scale-Up of Suspension HEK293 Cells for AAV Manufacturing（細胞あたり1×10⁵ vg、培養液あたり1×10¹⁴ vgを超える産生の報告）
• ROCTAVIAN（valoctocogene roxaparvovec）EU製品情報（Sf9ツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）の卵巣に由来する昆虫細胞です。バキュロウイルスと組み合わせ、懸濁培養で組換えタンパク質やAAVを作る系に使われます。詳しく →細胞とバキュロウイルスによる製造）
• Luo, et al. Evaluation of recombinant baculovirus clearance during rAAV production in Sf9 cells using a newly developed fluorescent-TCID50 assay. Front Med. 2024（昆虫細胞の系で残る組換えバキュロウイルスの除去）
• BioProcess International, Zolgensma: We all know the price, but how is it made?（HEK293の三重トランスフェクションHEK293系細胞に3種のプラスミドを同時導入し、一過性にAAVを産生させる代表的な手法。詳しく →）
• Wagner C, et al. Quantification of Empty, Partially Filled and Full Adeno-Associated Virus Vectors Using Mass Photometry. Int J Mol Sci 2024;25(2):838（AUCとの比較）
• Stability of the adeno-associated virus 8 reference standard material（ATCC VR-1816の3施設での測定）