トリプルトランスフェクションとは？等量で混ぜてよいのか

AAV（アデノ随伴ウイルス）遺伝子治療で広く使うウイルスベクター。宿主ゲノムに組み込まれにくく、導入遺伝子を長く発現しうる。詳しく →ベクターは、治療用の遺伝子を体の細胞へ運ぶ入れ物です。これを作るときに、3種類のプラスミド大腸菌の中で複製・増幅させる環状DNA。核酸医薬やベクター製造の伝統的な出発材料。詳しく →（環状のDNA）を同時に培養細胞へ入れ、粒子を組み立てさせる方法をトリプルトランスフェクションと呼びます。

3つを同じ量ずつ入れれば、3つが同じだけ働くのか。そうとは限らず、混ぜる比は収量だけでなく、中身の入っていない粒子がどれだけ出るかまで左右します。

この記事では、細胞に何を入れているのか、なぜ3つに分けるのか、等量では何が足りないのか、比を決めるときに何を一緒に振るのかを順に説明します。

1. トリプルトランスフェクションでは、3つのプラスミドが何を分担しているのか？

入れているのは、運びたい遺伝子、rep と cap、ヘルパーの3種類のプラスミドで、受け取る細胞にはヒト由来のHEK293細胞ヒト胎児腎臓由来の細胞。遺伝子導入効率が高く一過性発現に向くが、商業生産の実績はCHOより限定的。詳しく →が広く使われます。 ウイルスを種として加える作り方と違い、細胞に入るのはDNAだけです。

3つは、粒子を組み立てる仕事を分け合っています。

• 運びたい遺伝子のプラスミド⁠：治療に使う遺伝子を、両端の繰り返し配列（ITR）で挟んだものです。粒子に詰め込まれるのはITRに挟まれた部分だけで、長さの上限はおよそ4.7 kbです。
• rep と cap のプラスミド⁠：rep はゲノムの複製と詰め込みを、cap はカプシドを作るタンパク質を受け持ちます。血清型AAVのカプシドの種類による分類。組織指向性が異なり、狙う臓器や細胞に応じて選び分けられる。詳しく →を決めているのは cap の配列です。
• ヘルパーのプラスミド⁠：AAV遺伝子治療で遺伝子を運ぶウイルスベクター。血清型によって集まりやすい組織が異なる。詳しく →は単独では増えないため、増えるのに要る機能だけを載せます。

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受託先から見れば、プラスミドは3種類の別々の原料で、量もグレードも供給元も、それぞれそろえる必要があります。作り方はプラスミドDNAの製造工程にまとめました。

分担しているおかげで、cap を差し替えれば同じ設備で別の血清型を作れます。ただし、3つをどれだけ入れるかは、そのたびに考え直す必要があります。

2. なぜ、アデノウイルスを加えずに3つへ分けるのか？

3つに分けるのは、アデノウイルスそのものを使わずにAAVを作らせ、増える力を持つウイルスが製品に混ざる確率を下げるためです。

AAVは細胞に入っただけでは増えず、アデノウイルスなどが同じ細胞に入っているときにだけ増えます。この助ける側のウイルスが、ヘルパーウイルスです。初期の作り方では、実際にアデノウイルスを一緒に感染させていました。

その方法だと、作ったあとにアデノウイルスを取り除き、残っていないことを確かめる工程が要ります。加熱や精製で減らしても、増える力を持つウイルスが残っていないことを示す負担は消えません。

そこで、アデノウイルスのゲノムのうち、AAVを増やすのに要る機能だけを選んでプラスミドに載せ、rep と cap も製品のゲノムから切り離しました。残る機能の一部（E1領域）は、HEK293ヒト胎児腎由来の細胞株。アデノウイルスのE1機能を持ち、AAV産生の三重トランスフェクションで広く使われる。詳しく →細胞がもとから持っていて、この細胞が広く使われているのもそのためです。製品の粒子に詰まるのはITRAAVゲノムの両端にある逆位末端反復配列。複製とパッケージングのシグナルとして働き、この間の配列がカプシドに詰め込まれる。詳しく →に挟まれた部分だけなので、rep と cap は次の世代の粒子に持ち越されません。

3つに分けたのは、安全のための設計です。引き換えに、かつてウイルスの感染量で決まっていた仕込みのバランスを、工程側が比として決める役目が生まれました。

3. 重要：3つを等量で混ぜると、なぜ中身のない粒子が多く残るのか？

⁠カプシドの組み立てとゲノムの詰め込みが別の速さで進むため、等量の条件では、カプシドだけができて中身が入らない粒子が多く残ります。 カプシドが先にでき、詰め込みが追いつかなければ、その粒子は空のままです。この中身のない粒子を空カプシドと呼びます。

空カプシドは、あとの精製で分けて捨てるしかありません。狙った遺伝子を運べないうえ、投与する粒子の総数だけを押し上げるからです。

では、比を振り直せばどれくらい変わるのか。振とうフラスコ振とう機の上で揺らして培養液を撹拌・通気し、細胞や微生物を小規模に培養するためのフラスコです。詳しく →の培養で、AAV2とAAV9という2つの血清型について比を探した検討では、等量で混ぜた標準の条件に比べて、ベクターゲノムのコピー数で表したゲノム力価がどちらの血清型でも約2.2倍になり、空カプシドの割合は約4分の1減りました（Park J, et al. 2024）。

ほかから借りた標準の比をそのまま使っている工程には、上流で空カプシドを減らせる余地が残っている可能性があります。収量と純度がそろって良くなる最適化は、多くありません。

選ばれた比は、血清型で違いました。ヘルパーに対して rep と cap を多めに、運ぶ遺伝子を少なめにする向きは共通でしたが、その度合いには、2つの血清型の間でおよそ2倍の開きがありました。

下流の空カプシドとフルカプシドの分離は、境目の画分を捨てる工程です。持ち込む空の割合が低いほど、同じ収率でより高い純度に届きます。

このように、比は収量を決める条件であると同時に、精製でどれだけ捨てるかを先に決めてしまう条件です。

4. 比だけを詰めても、なぜ収量が頭打ちになるのか？

プラスミドは、そのままでは細胞に入りません。負の電荷を持つDNAに、正の電荷を持つ高分子を結びつけて複合体を作り、細胞に取り込ませます。この役目に最も広く使われているのが、ポリエチレンイミン正電荷を持つカチオン性試薬。負電荷のDNAと複合体を作り細胞へ導入するトランスフェクションに使う。詳しく →（PEI）です。

問題は、PEIに細胞への毒性があることです。rep と cap を多めにして総DNA量が増えれば、それに見合うPEIの量も増え、生存率が落ちて収量が下がることがあります。ゲノム力価だけを見ていては、下がった原因が比なのか毒性なのか分かりません。

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では、比の最適化そのものに意味がないのかというと、そうではありません。⁠効くのは、比と総DNA量と導入試薬の量を同じ計画の中で振り、ゲノム力価・空カプシドの割合・細胞の生存率の3つをそろえて見たときです。 条件を計画的に組み合わせて振る実験計画法（DOE）が使われるのは、この3つが互いに影響し合うためです。

規模を上げる段では、確かめ直しが要ります。複合体のでき方は混ぜ方に左右されるので、振とうフラスコで決めた条件が、そのまま槽の規模で出るとは限りません。DNAを入れるときの細胞の密度と、収穫のタイミングも収量を左右します。

ここまでは自社で条件を出す場合の話です。実際には、受託先が持つ標準の条件をどこまで見直せるかが問われます。試薬の種類はAAV用トランスフェクション試薬で比べられます。

5. 自分の工程では、比を見直す前に何から確かめるのか

最初に確かめるのは、比よりも後から変えにくいもの、つまり運ぶ遺伝子の長さと、いまの比がどこから来たかです。 確かめる順は、次のとおりです。

• 運ぶ遺伝子の長さ⁠：両端の繰り返し配列（ITR）に挟んで、およそ4.7 kb以内に収まるか。収まらなければ、比を詰める前に設計から考え直します。
• いまの比の出どころ⁠：自社の血清型と運ぶ遺伝子について、実験計画法（DOE、条件を計画的に振る方法）で決めた値か。ほかの品目からの流用であれば、振り直す前提で読みます。
• 同じ計画の中で振った範囲⁠：比と、導入試薬（ポリエチレンイミンなど）の量と、総DNA量を一緒に振ったか。比だけを振った検討なら、結果は条件つきで読みます。
• 評価の項目⁠：ゲノム力価だけか、空カプシドの割合と細胞の生存率も取っているか。空の割合が、下流の分離工程の負荷にどう効くと見込んでいるか。
• 規模と調達⁠：小さなスケールで決めた条件を、槽の規模で確かめた実績があるか。3種類のプラスミドの調達量・グレード・供給元が決まっているか。

遺伝子の長さと比の出どころが動けば、その下で取った値は取り直しです。血清型を替える案件なら、振る範囲の計画を組むところから始まります。

ゲノム力価を数える装置は、核酸を1分子ずつ数えるデジタルPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）の製品ガイドにまとめました。ロットごとにDNAを入れる作業そのものを無くす作り方との選び分けは、AAVの一過性トランスフェクションと安定産生細胞株で比べています。

AAV（アデノ随伴ウイルス）ベクターの工程全体はAAVの製造工程、受託先の選び方はウイルスベクター製造のCDMO（開発・製造受託機関）の選び方が、次の読みどころです。

参考文献

• Park J, et al. Enhancing the production of adeno-associated virus (AAV)2 and AAV9 with high full capsid ratio in HEK293 cells through design-of-experiment optimization of triple plasmid ratio. Biotechnology Journal. 2024;19(3):e2300667.（振とうフラスコでAAV2とAAV9のプラスミド比を実験計画法で最適化。等量の標準条件に対しゲノム力価が約2.2倍、空カプシドの割合が約4分の1減少。最適な比は血清型で異なる）
• Merck, Bioprocessing and Scale-Up of Suspension HEK293 Cells for AAV Manufacturing（浮遊HEK293細胞でのトランスフェクション培養細胞に外来の核酸を導入する操作。ウイルスベクターの一過性の産生などに用いられる。詳しく →と規模拡大）