AAV製造の不純物とは？肝臓への負担となぜ一緒に問われるのか

AAV製造の不純物とは、遺伝子治療に使うAAVベクターアデノ随伴ウイルスを改変して治療用遺伝子を細胞へ運ぶために用いる、非病原性の遺伝子導入用ウイルス粒子。詳しく →（治療遺伝子をカプシドに包んで細胞へ運ぶウイルス）を作るときに、目的の粒子と一緒に製品に残るもののことです。精製の工程を組む人、純度を測る人、ロットを出すかを決める人の仕事に関わります。

ただし、いま不純物が問われている理由は、規格の数字をそろえることだけではありません。全身に打つAAV遺伝子治療で遺伝子を運ぶウイルスベクター。血清型によって集まりやすい組織が異なる。詳しく →で重い肝障害が起きており、カプシドと一緒に体に入るものにも目が向けられ始めています。

この記事では、製品に何が残るのか、精製で落とせないものは何か、なぜ肝臓の話と結びつくのか、何を測るのかを順に説明します。

1. AAVの製品には、治療遺伝子を入れたカプシドのほかに何が残るのか

AAV製造の不純物は、治療遺伝子を入れたカプシド（フルカプシド）以外に製品に残るもので、カプシドの外にあるものと、カプシドと一体になったものに分かれます。 目的物によく似たものまで不純物に数えるのは抗体医薬と同じで、AAVでは中身のないエンプティカプシドがそれにあたります。

AAVを作るときは、細胞を増やし、プラスミド大腸菌の中で複製・増幅させる環状DNA。核酸医薬やベクター製造の伝統的な出発材料。詳しく →（遺伝子を運ぶ環状のDNA）を細胞に入れてカプシドを作らせ、回収してから何段も精製します。工程の全体はAAVベクターの製造工程で解説しています。この流れの中で、目的の粒子と一緒に次のものができます。

• カプシドの外にあるもの⁠：産生に使った細胞が持っていたタンパク質と、細胞やプラスミドのDNAの断片が残ります。このタンパク質を宿主細胞タンパク質（HCP）と呼び、どちらも材料の残りなので工程由来の不純物として扱います。
• カプシドそのもの⁠：治療遺伝子が入っていないエンプティカプシドができます。カプシドのタンパク質は目的の粒子と同じなので、製品由来の不純物として扱います。
• カプシドの中にあるもの⁠：細胞のゲノムの断片やプラスミドの骨格が、目的の遺伝子と一緒にカプシドに包まれることがあります。

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つまり、AAVの純度を考えるときは、カプシドの外に残ったものに加えて、カプシドそのものとカプシドの中身まで数に入れます。この3つは、精製で減らせる度合いが大きく違います。

2. カプシドの外の不純物は精製で減らせるが、カプシドと一体のものは残りやすい

カプシドの外にある不純物は精製の工程（DNAなら分解する酵素も）で減らせますが、カプシドの中のDNAとエンプティカプシドは精製だけでは取り切れません。

• カプシドの外のHCPとDNA⁠：クロマトグラフィー固定相と移動相の間での物質の相互作用（分配・吸着・イオン交換など）の差を利用して、混合物中の成分を分離・精製する操作の総称。詳しく →（担体カラムに充填する多孔質ビーズ。表面のリガンドと成分の相互作用差で目的物と不純物を分離する。詳しく →への付きやすさの差で物質を分ける方法）で目的の粒子から分けられます。むき出しのDNAは、核酸を分解する酵素でも細かくできます。
• カプシドの中のDNA⁠：精製では落とせません。酵素も精製の担体も、カプシドの内側には届かないからです。
• エンプティカプシド⁠：目的の粒子と大きさも表面もほぼ同じです。分ける方法はありますが、一部は製品に残ります。

では、精製で落ちないものは打つ手がないのでしょうか。そうではなく、上流（細胞にカプシドを作らせる段階）の設計で入りにくくし、残った量を測って示すことで扱います。詳しくはAAVのエンプティカプシドとAAVの残存DNAで解説しています。

このように、カプシドと一体の不純物は、製品にある程度入ったまま患者に届くと考えて量を見積もる必要があります。その量が問題になるのが、全身に打つ製品です。

3. 全身に打つAAVでは、なぜ不純物が肝臓の話になるのか

全身に打つAAVは1人に入るカプシドの数がけた違いに多く、その製品で重い肝障害が起きているため、カプシドと一緒に入るものの量も説明が要るようになっているからです。 ただし、製造由来の不純物が人の肝障害をどれだけ起こすのかは、まだ確かめられていません。

承認品でも、重い肝障害が警告されている

静脈内に打ったAAVは、血液に乗って全身を巡る間に、肝臓へも多く流れます。乳児の脊髄性筋萎縮症に使うオナセムノゲン アベパルボベクは、体重1 kgあたり1.1×10¹⁴ vg（vg：ベクターゲノム。運ぶ遺伝子のコピー数で、粒子の量の目安）を点滴します。

この製品の米国の添付文書には、重い肝障害と急性肝不全の枠囲み警告があります。投与の前日から副腎皮質ステロイドを飲ませ、投与の前後に肝機能を調べることも求めています。

つまり、この量を打つ製品では、肝臓を守る薬と検査を組み込んだうえで投与しています。

筋肉を狙うデランジストロゲン モキセパルボベクでも、2025年に、投与後の急性肝不全で歩行できない患者2人が亡くなったとFDAが報告しました。FDAはその後、重い肝障害の枠囲み警告を加え、使用を歩行できる4歳以上の患者に絞っています。血清型AAVのカプシドの種類による分類。組織指向性が異なり、狙う臓器や細胞に応じて選び分けられる。詳しく →と肝臓の関係はAAVの血清型と組織指向性で解説しています。

粒子が多ければ、カプシドと一緒に入るものも増える

カプシドの数がこれだけ多いと、残った割合が小さくても、体に入る不純物の量は大きくなります。エンプティカプシドは治療遺伝子を運びません。それでもカプシドの外側は目的の粒子と同じなので、免疫の側からは同じ異物に見えます。

AAV8（肝臓によく使われる血清型の1つ）のベクターでは、エンプティの粒子が最大で9割に及ぶロットが報告されています。同じ研究のマウスの実験では、一定量のベクターにエンプティの粒子を加えると肝臓での遺伝子導入が下がり、肝酵素（ALT、肝細胞が傷つくと血液に増える酵素）の上昇も伴いました。

人の肝障害の原因は、まだ分けて確かめられていない

マウスの結果は、人で同じことが起きると示したものではありません。人の肝障害が目的の粒子の量によるのか、一緒に入る不純物によるのかは、まだ分けて確かめられていません。FDAも2021年9月の諮問委員会で、AAVベクターの毒性のリスクを議題に取り上げています。

つまり、不純物は肝障害の原因と決まったものではありません。それでも、量の多い製品ほど、カプシド以外に何をどれだけ体に入れているかを数字で示す必要があります。

4. エンプティカプシド・DNA・HCPは、それぞれ別の方法で測る

1つの数字で不純物全体を表すことはできず、エンプティカプシドの割合、カプシドの外と中のDNA、HCPの総量と中身を、それぞれに合った方法で測って組み合わせます。

• エンプティカプシドの割合⁠：エンプティカプシドとフルカプシドの比率を測ります。同じ試料を複数の施設で測ると、手法によって値がばらつくことが、米国の国立標準技術研究所（NIST）が中心になった比較試験で示されています。
• カプシドの外と中のDNA⁠：抗体医薬で使われる1回の投与あたり10 ngという目安は、もともとワクチンの細胞基材のガイダンスから来た数字です。全身投与のAAVではベクターのDNAだけで量がけた違いに多いため、断片の長さと置き場所を含めて、製品ごとのリスク評価で許容範囲を決めます。
• 宿主細胞タンパク質（HCP）：ELISA（抗体で目的の物質を捕まえて測る方法）は総量を1つの値で返しますが、抗体が捕まえられるタンパク質しか数えません。LC-MS液体クロマトグラフで成分を分離したうえで質量分析計にかけ、分子量を測って物質の同定や定量を行う手法です。詳しく →（液体クロマトグラフィーと質量分析分子をイオンにして、質量と電荷の比で分け、分子の質量を精密に測る手法です。タンパク質の同定、修飾の位置の特定、不純物の確認などに使い、液体クロマトグラフと組み合わせることが多くあります。詳しく →をつないだ装置）は、個々のタンパク質を見分けて量を見積もれます。

測った値をどこまで許すかにも、全製品に共通の数値基準はありません。ICH Q6B生物薬品の規格・試験方法の設定の考え方を示すICHガイドライン。力価などの規格を扱う。詳しく →（バイオ医薬品抗体や組換えタンパク質など、生きた細胞や微生物に作らせる医薬品の総称です。細胞治療・遺伝子治療の製品を含めて呼ぶこともあります。化学合成で作る核酸医薬やペプチドは、ふつう含めません。詳しく →の規格の決め方を示した国際ガイドライン）は、規格を製品ごとに根拠を示して決める考え方をとっています。

つまり、エンプティカプシドの上限も、投与量・投与経路・対象疾患を踏まえて製品ごとに決め、その理由を当局に説明できるようにしておきます。測り方の詳細は、HCP ELISAとLC-MSによるHCP解析で解説しています。

このように、純度の試験報告を読むときは、合否の数字より、どの方法で測ったのかと、上限をなぜその値にしたのかを見ます。

5. 1人に入る粒子の総量から、不純物の上限の根拠を確かめる

最初に1人に入る粒子の総量を出し、その量を基準に、不純物ごとに測り方と上限の根拠を確かめます。 次の順に見ます。

• 1人に入る粒子の総量を出す⁠：体重あたりの量（ベクターゲノム、vg/kg）に、対象患者の体重を掛けます。局所に打つ製品と全身に打つ製品では、ここで量のけたが変わります。
• エンプティカプシドの割合を、方法と一緒に記録する⁠：割合の値だけでなく、どの手法で測ったかを残し、できれば原理の違う2つ目の方法でも確かめます。
• DNAを、カプシドの外と中に分けて見る⁠：酵素で減らせるカプシドの外のDNAと、精製では落とせないカプシドの中のDNAを分けて測り、断片の長さも確かめます。
• 宿主細胞タンパク質（HCP）を、総量と中身で見る⁠：酵素免疫測定法（ELISA）の総量に加え、液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）分子の質量を精密に測る分析。液体クロマトと組み合わせ、ポリAテール長などを詳しく解析します。で個々のタンパク質を見たかを確かめます。
• 上限値の根拠を、総量から説明できるか確かめる⁠：抗体医薬の目安をそのまま当てていないか、1人に入る粒子の総量を踏まえて決めたかを見ます。

受託先の試験報告を受け取る立場なら、5つの項目に値と方法と根拠がそろっているかを読みます。値だけが並び、方法や根拠が書かれていない項目は、追加で問い合わせる候補です。

製造の変更を考えている立場なら、変更の前後で同じ5つを並べて比べます。産生の方式や細胞を替えると、エンプティカプシドの割合やカプシドの中のDNAの量が変わることがあります。だからこそ、変更の前に測り方をそろえておきます。

つまり、総量の数字が1つあれば、どの不純物の上限が説明不足かを順に洗い出せます。品質試験の全体は遺伝子治療の品質管理で解説しています。

参考文献

• FDA, Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)
• EMA, Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products
• FDA, ZOLGENSMA (onasemnogene abeparvovec-xioi) Prescribing Information（体重1 kgあたり1.1×10の14乗 vg、重い肝障害と急性肝不全の枠囲み警告、副腎皮質ステロイドの併用と肝機能の検査）
• FDA, FDA Investigating Deaths due to Acute Liver Failure in Non-Ambulatory Duchenne Muscular Dystrophy Patients
• FDA, FDA Takes Action: New Boxed Warning for Acute Serious Liver Injury and Acute Liver Failure Following Elevidys（2025年11月14日）
• Federal Register, Cellular, Tissue, and Gene Therapies Advisory Committee; Notice of Meeting（2021年7月26日告示、2021年9月2〜3日開催）
• Gao K, et al. Empty virions in AAV8 vector preparations reduce transduction efficiency and may cause total viral particle dose-limiting side effects. Mol Ther Methods Clin Dev. 2014;1:9.（空が最大9割に及ぶロット、マウスでの導入効率の低下とALTの上昇）
• Werle AK, et al. Comparison of analytical techniques to quantitate the capsid content of adeno-associated viral vectors. Mol Ther Methods Clin Dev. 2021;23:254-262.（空カプシドは製品由来不純物として扱う）
• NIST, Study Highlights Need for Standardized Measurement Methods in Gene Therapy（空と実の比率の、手法ごとの施設間のばらつき）
• ICH医薬品規制の国際調和を目的として、日米欧の規制当局と製薬業界が参加する国際的なガイドライン策定機関。詳しく → Q6B, Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products
• FDA, Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications（2010年。1回の投与あたり10 ngの目安の出どころ）
• Cell and Gene Therapy Insights, Impurities in viral-based therapeutics: mastering residual hcDNA: a harmonized approach for AAV gene therapies（カプシド内のDNAは、数値の上限ではなくリスク評価で管理される）