遺伝子治療基礎知識・精製

エンドヌクレアーゼ処理とは？核酸を切っても除けない理由と選び方

Proglenth 編集部公開 2026-08-24更新 2026-10-09約6分で読めます

核酸を分解する酵素を加えたのに、最終製品の残存DNAが思うように下がらない。AAVの製造では、こうしたことが起こりえます。酵素が切れるのは、ウイルス粒子の外にある核酸だけで、カプシド（ウイルス粒子の殻）の中に入ったDNAには届かないからです。

残存DNA qPCR#エンドヌクレアーゼ#残存DNA#清澄化#AAV

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エンドヌクレアーゼ処理は、ベンゾナーゼ（商品名）に代表される、DNAとRNAを区別せずに切る酵素を工程液に加える操作です。粘度を下げて後ろの工程を回しやすくし、残るDNAを短くする役目があります。ただし、切ることと除くことは別の操作で、酵素そのものも新しい不純物として扱われます。

工程設計の人は条件の決め方を、購買は酵素の選び方を、品質保証は加えた酵素の残存管理を、ここで押さえられます。

何のために切るのか ― 粘度と残存DNA

細胞を壊した液や、細胞が死んで中身が漏れ出た培養液には、宿主由来の核酸が大量に含まれます。これが2つの形で工程の邪魔をします。

1つめは粘度です。長いDNAは、わずかな量でも液をどろどろにします。ハーベストと清澄化でフィルターがすぐ詰まり、深層ろ過の処理量が落ち、遠心でも分離が悪くなります。酵素で短く切ると、液はさらさらに戻ります。

2つめは、最終製品に残る宿主細胞DNAです。量だけでなく、断片の長さも管理の対象で、長い断片ほどリスクが高いと考えられています。ワクチンの残存DNAについては、WHOとFDAが、1回分あたり10 ng以下、断片の長さは約200塩基対以下を目安として示してきました。切って短くすること自体に意味があります。

AAVの製造では、この負荷が特に大きくなります。トランスフェクションに使ったプラスミド、宿主細胞のゲノムDNA、ヘルパー由来の核酸が、同じ液に混ざるためです。

切る目的は2つあります。液をさらさらにすることと、残るDNAを短くすることです。

切っても除けない ― 後ろの工程と、カプシドの中

よくある誤解は、酵素を加えれば核酸が消えるというものです。酵素は核酸を短い断片まで切りますが、断片は液の中に残ります。除くのは後ろの工程の役目です。

工程	核酸に対する働き
清澄化・深層ろ過	粘度が下がるので、処理量が増える
アフィニティ捕捉	目的物を保持し、断片は素通りさせる
陰イオン交換	負に帯電した核酸断片を吸着させる
限外ろ過	小さな断片を透過側へ抜く

つまりエンドヌクレアーゼ処理は、後ろの工程が効くようにするための前処理です。

もう一つの限界が、カプシドの中です。AAVのカプシドは核酸を包む殻で、目的の遺伝子のほかに、宿主細胞のDNAの断片やプラスミドの骨格が間違って詰め込まれることがあります。殻の中の核酸は酵素の相手になりません。粒子の外にある残存DNAは精製で除けますが、中に入ったものは除きにくく、目的のAAVと一緒に精製されてきます。Sf9細胞を使う系では、BioMarin のポスターのように、残存DNAを粒子の外と中に分けて評価した報告もあります。詳しくはAAV製造における残留DNAの管理で解説しています。

エンドヌクレアーゼ処理の前、後、後ろの工程を左から右へ並べた概念図。左は酵素を加える前で、長いDNAがうねって液がどろどろの状態にあり、DNAを殻の中に持つAAV粒子が2つある。中央は酵素を加えたあとで、粒子の外の長いDNAは短い断片に切れて液はさらさらになるが、断片は液に残る。粒子の殻の中のDNAは切れない。右は後ろの工程で、アフィニティ捕捉は目的物を保持して断片を素通りさせ、陰イオン交換は負に帯電した断片を吸着し、限外ろ過は小さな断片を透過側へ抜く。殻の中のDNAは除かれず、目的のAAVと一緒に出てくる。 — 酵素が切るもの、切れないもの、後ろの工程で除くものの概念図

POINT

酵素を増やしても残存DNAが下がり止まるなら、残りは粒子の中にある可能性を疑います。対策は酵素の量ではなく、プラスミドや産生細胞の設計など、上流で入りにくくする側にあります。

酵素が切れるのは粒子の外の核酸です。粒子の中の核酸は、酵素の量を増やしても減りません。

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酵素が働かない失敗 ― 塩、EDTA、温度

酵素反応である以上、液の条件が結果を決めます。同じ酵素を同じ量だけ加えても、働かない工程があります。

まず、マグネシウムイオン（Mg2+）です。多くの非特異的ヌクレアーゼは、Mg2+がないと働きません。上流の緩衝液にキレート剤のEDTAが入っていると、EDTAがMg2+を奪うので、酵素を加えても反応が進みません。緩衝液の組成は、酵素の要求に合わせて調整します。

次に塩です。多くのヌクレアーゼは、塩化ナトリウムが150 mM前後までの条件で働きます。AAVの製造では、カプシドの凝集を防ぎ、酵素を効かせやすくするために、400〜600 mMの高い塩濃度で処理することがあります。この条件では、標準的な酵素は十分に働かないとArcticZymesは説明しています。同社の塩に強いヌクレアーゼ（SAN）は、製品によって400〜700 mM前後で最もよく働くとされます。自社の液の塩濃度が、使う酵素の働く範囲に入っているかを、メーカーの資料と自社の試験で確かめます。

温度、時間、酵素の量も振る条件です。酵素が多いほど速く進みますが、コストと酵素の残存量が増えます。温度を上げれば速くなりますが、目的物の安定性に響きます。時間は、工程時間に収まる範囲で決めます。

効果の確認は、粘度の低下を目で見るだけでは足りません。残存DNAの量をqPCRやddPCRで、断片の長さの分布を電気泳動で測ります。「切れてはいるが、短くなりきっていない」状態を拾える設計にしておきます。

同じ酵素でも、液の塩とEDTAしだいで、働かない工程が出ます。条件は自社の液で試して決めます。

酵素の選び方と残存管理 ― 比べる軸と供給

エンドヌクレアーゼは、工程に加える原材料です。選ぶときは、価格と活性の単位だけで比べず、次の4点を聞きます。

自社の液で働くか。塩濃度とMg2+の条件がそろうかを、自社の液で確かめます。

グレードと書類。研究用かGMPグレードか、動物由来成分を使っていないか、エンドトキシンの規格があるか。由来と製法が申請書類に書けるか。供給者管理と受入試験で、CoAに頼ってよい根拠を先に作ります。

ロット間の差。活性が同じ単位で規定されていても、測定条件が供給者ごとに違えば、実際の分解の程度は変わりえます。自社の液での分解速度を、ロットごとに確かめておく運用が現実的です。

残存量を測れるか。加えた酵素は、最終製品に残れば工程由来不純物として扱われます。後ろの工程で除かれることを示し、最終製品での残存量を残存ヌクレアーゼのELISAで測り、規格か工程内管理の項目にします。宿主細胞タンパク質の管理と似た枠組みですが、意図して加えたものである点が違います。ELISAは酵素のタンパク質を測るので、酵素を替えると、測る抗体が反応するかを確かめ直します。

供給にも気を配ります。この酵素は、供給者が限られること、単価が高いことが課題に挙げられてきました。大腸菌で作ること自体も難しい酵素です。自分の核酸を切る酵素を菌の中で作ると、菌が傷むためです。菌体の外へ出す系などの研究も報告されていますが、研究の段階です（ニュース）。別の酵素への切り替えは、原材料の変更として同等性の確認が要ります。

酵素に頼らない手立てもあります。陽イオン性のポリマーで核酸を沈殿させる方法は酵素より安価ですが、目的物が一緒に沈むことがあります。陰イオン交換で核酸を吸着させ、目的物を素通りさせる方法は、目的物も負に帯電していると使えません。もっと根本にあるのは、上流で細胞の生存率を保ち、核酸が漏れ出る量を減らすことです。⁠下流で苦労する量は、上流で決まっています。