残存DNAを工程でどう除くか？断片化・ヌクレアーゼ・クリアランス設計

量と断片長、両方を下げる理由

管理の出発点は、産生細胞のゲノムDNAが持ちうる二つの理論的リスク——がん遺伝子配列に由来する造腫瘍性（oncogenicity残留DNAなどが含む遺伝子配列が正常細胞のがん化を引き起こす可能性を示す性質のこと。）と、ウイルス配列が残る場合の感染性（infectivity）です。ここで効いてくるのが 断片長 です。同じ量でも、長いDNAほど機能を持ちうるため危険度が高く、短く切れていればリスクは下がると考えます。だから除去工程は「総量を減らす」だけでなく「断片を短くする（おおむね200 bp以下を目安）」ことも狙います。WHOのガイダンスでは連続細胞株無限に増殖できる不死化した細胞株。ゲノムにオンコジーンを含み、残存DNA管理の対象になる。由来製品で 10 ng/ドース 程度が一つの目安とされ、ICH Q6Bは残存DNAを最小化すべき工程由来不純物mRNA製造などで生じる二本鎖RNA(dsRNA)や鋳型DNAなど、製造工程に由来する不純物の残存量を調べる試験です。詳しく →と位置づけています。

ヌクレアーゼ処理──切って小さくする

一つ目の主役が ヌクレアーゼ処理DNAを分解する酵素で残存DNAを短く切る処理。断片サイズを下げて理論的リスクを減らす。 です。ベンゾナーゼに代表されるエンドヌクレアーゼ核酸を分解する酵素です。製造では培養由来の残存DNA/RNAを分解・除去して製品の純度を高める目的で使い、ベンゾナーゼが代表例です。詳しく →は、DNA（およびRNA）を核酸鎖の内部から次々に切断し、長い鎖を短い断片へと崩します。これには二つの効果があります。第一に、細かくなったDNAは後段の吸着除去で除きやすくなること。第二に、断片長そのものが下がること——つまり量と質の両方に効きます。ヌクレアーゼは培養後半や清澄化前後で加えられ、作用後は自身も不純物になるため、下流でしっかり除去されることを確認します。

陰イオン交換とメンブレンによる吸着除去

二つ目の主役が 陰イオン交換（AEX）のフロースルークロマトグラフィーで担体に結合せず素通りして流れ出る画分。不純物を通過させて除く場合などに利用する。 です。DNAはリン酸骨格ゆえ強く負に帯電しているため、中性〜弱塩基性の条件では陰イオン交換体に強く吸着します。目的の抗体を素通り（フロースルー）させながら、DNAだけを担体に捕えて分離する——これがポリッシング捕捉工程の後、電荷や疎水性の違いを使って残った副産物を削り純度を上げる磨き上げ精製。段の定番設計です。近年は、樹脂カラムに代えて 陰イオン交換正に帯電した担体に負電荷の物質を吸着させて分離する手法。フロースルーでDNAやウイルスを除くのに使う。メンブレン（メンブレンアドソーバー） を使い、高流量でDNA・ウイルス・エンドトキシンをまとめて吸着する構成も広く採られます。メンブレンは対流で物質が膜に届くため、大きな分子の吸着が速く、使い捨てで洗浄バリデーション設備を洗浄した後、前の製品の残留がないことを検証し交叉汚染を管理する活動。も省けるのが利点です。

重要なのは、このAEX正の電荷を帯びたクロマト担体で、負に帯電した分子を静電的に吸着して分離します。タンパク質精製や、DNA・不純物の除去に使われます。詳しく →フロースルーが ウイルスクリアランスや酸性HCP除去と同じ工程で効く ことです。負に帯電した不純物を一網打尽にできるため、DNA除去はウイルス安全性製造工程がウイルスをどれだけ除去・不活化できるかを評価し、製品の安全性を確保する取り組みです。各工程の低減能力を対数の値で示します。詳しく →の作り込みと地続きで設計されます。

クリアランスをどう示すか

工程がDNAを狙いどおり落とせるかは、⁠クリアランスの評価 で裏づけます。各工程の入口と出口のDNA量をqPCRで測り、除去係数ある工程で不純物がどれだけ除去されるかを表す係数。掛け合わせて下流での消失を定量的に示す。（対数除去値）を把握します。ウイルスクリアランスと同様、意図的にDNAを負荷して除去能に余裕（安全域）があるかを見るスパイク既知量の基準物質を試料に添加すること。質量分析のシグナルを濃度に結びつけてHCPを定量するために行う。的な検討も行い、運転範囲が変動しても十分に除けることを確認します。こうして、ヌクレアーゼで「切って小さく」、AEX/メンブレンで「吸着して除く」を組み合わせ、量と断片長の両面をクリアランス評価で担保する——それが残存DNA製造に使った宿主細胞に由来するDNAの不純物です。安全性の観点から、精製後にどれだけ残っているかを測る試験です。詳しく →除去の設計の全体像です。

メンブレンと樹脂の使い分け

陰イオン交換分子の電荷の違いを利用して分離するクロマトグラフィー。フラグメントなど定型ツールが効かない分子でも使える。でDNAを吸着するとき、担体カラムに充填する多孔質ビーズ。表面のリガンドと成分の相互作用差で目的物と不純物を分離する。には 樹脂カラム と メンブレンアドソーバー の二つの形があり、性格が違います。樹脂は単位体積あたりの吸着容量が大きく繰り返し使えますが、洗浄・再生と洗浄バリデーションの手間がかかります。メンブレンは、対流で分子が膜に届くため大きな分子（DNA・ウイルス）を速く捕まえられ、高流量で流せて使い捨て使い捨ての樹脂製バッグや容器を用いる製造方式です。洗浄・滅菌の手間を減らせる一方、ステンレス設備と比べて特徴が異なり、目的に応じて選び分けます。詳しく →にできる一方、容量あたりのコストは高めです。残存DNAのように「微量を確実に除きたい」ポリッシング用途では、容量をさほど要さず高流量・使い捨ての利点が生きるメンブレンがよく選ばれます。処理量・コスト・除去対象の量を見比べて使い分けます。

クリアランスをどう設計するか

除去能の裏づけは クリアランス試験 で示します。各工程の入口と出口のDNAを測って対数除去工程の前後で不純物やウイルスが何桁減ったかを対数で表す指標。除去能を定量的に示す。値（LRV）を積み上げ、想定される最悪の入力量に対しても十分な安全域があることを確認します。DNAを意図的に負荷（スパイク）して除去能を測る手法は、ウイルスクリアランス試験と同じ考え方で、両者はしばしば一体で計画されます。工程が変動しても除去が保たれることまで示して、初めて「工程で作り込んだ」と言えます。

まとめ

残存DNAは、造腫瘍性iPS細胞などに由来する製品で、分化しきらず腫瘍化する恐れのある細胞が残っていないか調べる安全性評価です。詳しく →・感染性という理論的リスクゆえに、量と断片長の両面で下げます。ヌクレアーゼ処理でDNAを細かく切り、陰イオン交換フロースルーやメンブレンで負電荷を利用して吸着除去する——この二段が主役です。AEXはウイルスや酸性HCPも同時に除くため一体で設計し、クリアランス評価で除去の余裕を示します。測定（qPCR核酸を増幅しながら蛍光の増え方を追い、標的DNA・RNAの量を測る装置です。増幅の立ち上がりの早さから濃度を求めます。詳しく →）と合わせ、工程で作り込むのが残存DNA管理の要です。

参考文献

• USP米国で医薬品・原料・試験法の公式基準を定める公定書で、製薬用水に関する規格も収載されている。, 〈509〉 Residual DNA Testing
• USP, Residual DNA Testing — USP General Chapter〈509〉（資料）
• ICH医薬品規制の国際調和を目的として、日米欧の規制当局と製薬業界が参加する国際的なガイドライン策定機関。, Q6B Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products