メンブレンクロマトグラフィーとは？樹脂との違いと使いどころ

洗浄の手間がなく、DNAやウイルスを速い流速で落とせるなら、精製のカラムを全部、膜に替えればよいのではないか。そう考えた人が最初にぶつかるのは、膜の得意と苦手がはっきり分かれていることです。

メンブレンクロマトグラフィー（吸着膜）は、多孔質の膜にクロマトグラフィーの官能基（リガンド）を付けたもので、樹脂を詰めたカラムの代わりに液を通します。強いのは、DNA、ウイルス、宿主細胞由来タンパク質（HCP）生産に使う細胞に由来し製品に残るタンパク質不純物。精製で除去し、残存量を管理します。詳しく →のような、大きくて電荷の強い不純物を、抗体を通しながら高い流速で削り落とす仕事です。反対に、抗体をたくさん捕まえる仕事や、よく似た分子を分け取る仕事は、いまも樹脂が上です。

洗浄バリデーション設備を洗浄した後、前の製品の残留がないことを検証し交叉汚染を管理する活動。詳しく →を減らしたい工程担当者にも、使い切りの資材を比べる購買にも、ウイルス除去の根拠を読む品質保証にも、膜をどこに置くと効くのかを知っておく価値があります。

膜と樹脂 ― 分子が届く道の違い

膜と樹脂の差は、突き詰めると、分子がリガンド担体ビーズ表面に結合させた官能基やタンパク質で、目的物や不純物と相互作用して分離を担う部分。詳しく →に届くまでの道の違いです。

樹脂は、小さなスポンジの玉を詰めたようなものです。リガンドの大半は玉の内側にあり、分子は液の流れで玉の表面まで運ばれたあと、細かい孔を自力で歩いて奥へ進みます（拡散）。この歩く速さが全体の速さを決めるので（拡散律速）、流速を上げると奥に届く前に通り過ぎ、捕まえられる量が落ちます。DNAやウイルスのように大きな分子は歩くのが遅く、とくに不利です。

膜は、貫通した孔の壁にリガンドが付いています。液がそのまま孔を通り抜けるので、分子は流れに乗ったまま、リガンドのすぐそばを通ります。奥へ歩く必要がないため、流速を上げても捕まえる力が落ちにくいのです。

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膜は「流れの中で一瞬で捕まえる」仕事に、樹脂は「たくさん捕まえて、じっくり分ける」仕事に向いています。

膜が働く場所 ― 素通し運転の仕上げ

いちばん定着した使い方は、陰イオン交換（AEX）の膜を、Protein A抗体に特異的に結合するProtein Aを担体に固定し、抗体だけを選択的に捕まえて精製する手法です。抗体医薬の最初の精製工程として定番になっています。詳しく →や前段のクロマトグラフィー固定相と移動相の間での物質の相互作用（分配・吸着・イオン交換など）の差を利用して、混合物中の成分を分離・精製する操作の総称。詳しく →の後ろに置き、素通し（フロースルークロマトグラフィーで担体に結合せず素通りして流れ出る画分。不純物を通過させて除く場合などに利用する。詳しく →）で流す運転です。

抗体は多くの条件で膜に付かず通り抜け、負に荷電したDNA、エンドトキシングラム陰性菌の外膜由来の発熱性物質（LPS）で、注射剤では厳しく管理し、LAL試験などで測定します。詳しく →、酸性のHCP、ウイルス、樹脂から外れたProtein Aが膜に残ります。捕まえる相手がごく少量なので、体積あたりの容量が小さいという膜の弱点が出にくく、大量の液を高い流速で流し込めます。ポリッシング捕捉工程の後、電荷や疎水性の違いを使って残った副産物を削り純度を上げる磨き上げ精製。詳しく →全体の割り振りは抗体精製ポリッシングとは？で解説しています。この用途の膜は新製品も続いていて、Cobetter が、そのまま使える強陰イオン交換正に帯電した担体に負電荷の物質を吸着させて分離する手法。フロースルーでDNAやウイルスを除くのに使う。詳しく →の膜 Purcise Q を発表しました（ニュース）。

ウイルスの除去にも使われます。膜への吸着は電荷で捕まえる仕組みで、大きさで止めるウイルスろ過とは原理が違うので、組み合わせると互いの弱点を補えます。ただし、除去量は条件で動きます。メーカーの技術資料には、pHが下がってウイルスの等電点（正味の電荷がゼロになるpH）に近づくと、パルボウイルスエンベロープを持たない極めて頑健な小型ウイルス。化学処理に強く、除去はサイズ排除のろ過が有効。詳しく →のモデルであるマウス微小ウイルスの除去が落ち、液の導電率液のイオン強度の目安となる電気の通りやすさ。バッファ調製やクロマト制御で監視する。詳しく →（塩の濃さの目安）を下げると補える、という記述があります。導電率、載せる量、工程の一時停止、加えるウイルス標品の質が、除去量を左右する条件として検討された報告もあります。除去量は抗体ごとにも違うので、他の抗体の値は持ち込めません（ウイルスクリアランス）。

導電率には、実務でもう1つ関わりがあります。従来の四級アミンの膜は、導電率の低い液でないと働きにくいため、Protein Aの溶出液クロマトグラフィーで担体に結合した目的物質を引きはがして回収するための緩衝液で、アフィニティ精製では低pHがよく使われます。詳しく →や前段のプールを水で薄めて塩を下げる必要がありました。薄めれば体積が増え、タンクが要り、時間が延びます。そこで塩に強い膜が出ていて、Sartorius は Sartobind STIC を、希釈を省くための膜として案内しています。Merck の NatriFlo HD-Q も塩への強さをうたう製品です。塩に強いといっても無条件ではないので、どの導電率まで除去が保たれるかは、膜と抗体の組み合わせで確かめます。

キャプチャ培養液から目的の抗体だけを大きく濃縮・精製する工程。抗体医薬ではプロテインAが担う。詳しく →（抗体を最初に捕まえる工程）への広がりもあります。膜は短い時間で何度も回せるため、Protein Aの膜が出てきていて、連続キャプチャとの組み合わせも検討されています。

膜を置く場所は、「大きな不純物を、抗体を通しながら削る」工程です。

使い切りの利点と、見落としやすいコスト

膜は、デバイスに充填されて、多くは照射滅菌済みで届きます。カラムを自分で詰める必要がなく、使い切りなので、洗浄と再生のバリデーション試験法が目的に合う性能を持つことを立証する妥当性確認。正確さ・精度などを評価する。詳しく →も、前のロットの持ち越しの評価も要りません。床が薄く、装置も小さくできるので、多品種を切り替える施設や、開発初期の素早い立ち上げに向いています。単回使用とステンレスの選択の判断材料にもなります。

一方、使い切りは消耗品と廃棄物を毎回生みます。実生産の規模では、容量とコストの面で採用が進みにくかったことは、業界の資料にも書かれています。少ロットの臨床用の製造では、樹脂のカラムは寿命のごく一部しか使わないのに、充填、洗浄、保管の手間は同じだけかかるので、膜が有利になりやすい場面です。大量に長く作るなら、再生して繰り返し使える樹脂が安くなることもあります。

膜の消耗品費だけでなく、樹脂の洗浄、バリデーション、保管の手間を並べ、ロット数と年数で比べないと、安いか高いかは決まりません。

よくある失敗

1つめは、樹脂の物差しで膜を測ることです。体積あたりの結合容量担体が結合できる目的物の量。大きな粒子は樹脂ビーズの細孔に入りにくく、結合容量を稼ぎにくい。詳しく →（動的結合容量）を並べると、膜は小さく見えます。素通し運転では捕まえる量が少ないので問題になりませんが、抗体をたくさん捕まえるキャプチャを膜に任せると、容量が足りなくなります。

2つめは、前段のプールの導電率とpHを測らずに膜を決めることです。塩の濃い液に低い導電率向けの膜を当てると、希釈でタンクが増えます。pHを動かせば、ウイルスの除去も動きます。

3つめは、メーカーの資料や他の抗体のウイルス除去の値を、自社の工程の根拠にすることです。除去量は、自社の抗体と、載せる液の条件で決まります。

4つめは、似た分子を分け取る仕事を膜に期待することです。電荷の差が小さい分子を、溶出の途中で分けるのは、床の薄い膜が苦手とする仕事です。

5つめは、小さなデバイスで決めた条件が、製造規模で再現しないことです。膜は床が薄いぶん、デバイス内の流れの偏り（チャネリング）や、配管などのすき間（デッドボリューム容器やデバイスに残って投与に使われない液量。過充填量を決める際に考慮する。詳しく →）が、回収率添加した既知量の標準物質に対して試験で実際に測定された値の割合を示す指標で、試験の正確さを表す。詳しく →に響きやすくなります。数 mL の小型から製造規模のカプセル、カセットまで、同じ膜の化学で揃えている製品なら、条件を移しやすくなります。

明日から確かめられること

膜を検討するとき、あるいは受託先の工程に膜が入っているときに、次の点を確かめてください。

• 膜に任せるのは、不純物を素通しで落とす仕事か、抗体を捕まえる仕事か
• 前段のプールの導電率とpHはいくつで、希釈が要るか。塩に強い膜が要るか
• ウイルス除去の根拠は、自社の抗体で、使うpH、導電率、載せる量の条件で取ったデータか
• 載せる量と流速の上限は、破過フィルターの保持能力の限界を超え、除去対象の微生物や粒子がろ液側に通り抜けてしまう現象。詳しく →（不純物が漏れ始める点）を実測して決めたか
• 小型のデバイスから製造規模まで、同じ膜か
• 消耗品費と廃棄物を、ロット数と年数で、樹脂の洗浄とバリデーションの手間と比べたか
• 抽出物・溶出物の資料があるか。製品を変更するときの事前連絡は約束されているか

製品はメンブレンクロマトグラフィー、比べる相手のAEXレジンで見られます。樹脂か膜かを含めた選び方は精製クロマトの担体（レジン）の選び方、液の導電率を決めるイオン強度溶液中のイオンの量の指標。塩を加えると静電的な引力を覆い隠し、粘度を下げられることがある。詳しく →の考え方はイオン強度とバッファー設計で解説しています。

参考文献

• ICH Q5A(R2)細胞株由来のバイオ医薬品について、ウイルス安全性評価の枠組みを示すICHガイドライン。詳しく →, Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin（ウイルス安全性製造工程がウイルスをどれだけ除去・不活化できるかを評価し、製品の安全性を確保する取り組みです。各工程の低減能力を対数の値で示します。詳しく →を工程全体で確保する考え方）
• Merck（MilliporeSigma）, mAb Membrane Purification（AEX正の電荷を帯びたクロマト担体で、負に帯電した分子を静電的に吸着して分離します。タンパク質精製や、DNA・不純物の除去に使われます。詳しく →膜の素通し運転、pHと導電率の影響、塩に強い膜。メーカーの技術資料）
• Merck（MilliporeSigma）, NatriFlo HD-Q viral clearance application note（AN650EN）（pHが下がるとマウス微小ウイルスの除去が落ち、導電率を下げると補えるとする記述。メーカーの資料）
• BioPharm International, Using Anion Exchange Membrane Adsorbers to Ensure Effective Virus Clearance of Challenging Parvoviruses（導電率、工程の一時停止、載せる量、ウイルス標品の質の検討）
• 3M, Economic evaluation of 3M Polisher ST replacing an AEX polishing column（使い切り膜の採用が、容量とコストの面で進みにくかった経緯。メーカーの資料）
• Ghosh R. Protein separation using membrane chromatography: opportunities and challenges. J Chromatogr A. 2002.（膜クロマトグラフィーの原理と課題）