疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）とは？凝集体除去の要

HICの原理──高塩で吸着、低塩で溶出

HICの担体には、フェニル基やブチル基といった疎水性のリガンドが付いています。タンパク質の表面にも疎水的な領域があり、両者が水を嫌って寄り合う（疎水性相互作用分子表面の疎水性の差で分けるクロマトグラフィー。）ことで吸着が起きます。この相互作用は、水分子が疎水面のまわりで規則正しく並ぶ状態を解消してエントロピーが増える方向に進む、いわば「水が押し出す」力に支えられています。

ここで独特なのが塩の使い方です。高濃度の塩（硫酸アンモニウムなど）を加えると、タンパク質まわりの水和水がはがれて疎水面が露出し、リガンド担体ビーズ表面に結合させた官能基やタンパク質で、目的物や不純物と相互作用して分離を担う部分。への吸着が強まります。逆に塩を下げていくと、水和が戻って吸着がゆるみ、疎水性分子が水と親和せず、油脂や非極性溶媒と相互作用しやすい性質で、二本鎖RNAと一本鎖RNAではその程度が異なり分離の指標となる。の弱いものから順に溶出します。つまり 高塩でロード、塩を下げて溶出 という、イオン交換（低塩でロード、塩を上げて溶出）とは逆の作法になります。この違いが直交性塩基と酸のように外れる条件が異なる保護基を組み合わせ、互いに干渉させない設計。の源で、同じ試料に対してイオン交換とHICを組み合わせると、性質の異なる不純物をそれぞれ削ぎ落とせます。

塩の選び方──Hofmeister系列

HICで使う塩は何でもよいわけではありません。イオンには、水を強く構造化して疎水性相互作用を促す コスモトロピック（水構造形成性） なものと、逆に相互作用を弱める カオトロピック なものがあり、その序列は Hofmeister系列 として知られています。硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムといったコスモトロピックな塩は、低い濃度でも吸着を強く促すため、HICのロード塩として好まれます。中でも硫酸アンモニウムは効きがよく実績も豊富ですが、後述のとおり消費量と廃液が課題になります。塩の種類と濃度は、目的物をしっかり吸着させつつ溶解性を損なわない範囲（塩析による沈殿を避ける）で決めるのが実務です。

なぜ凝集体除去に強いのか

抗体が凝集すると、単量体では内側に隠れていた疎水面が表面に出やすくなります。結果として凝集体は単量体より疎水性が高く、HICでより強く吸着します。この差を利用して、溶出のグラデーションの中で単量体を先に取り、疎水性の高い凝集体を後ろに残す（あるいは吸着させ切る）ことができます。電荷の物差しでは単量体と近接してしまう二量体同種の分子が2つ結合した会合体で、インスリンが六量体から解離する際に経る中間的な状態。・多量体も、疎水性の物差しなら差がつきやすいのが強みです。HICは凝集体だけでなく、HCPや漏出したProtein Aリガンド、一部のウイルスの除去にも寄与する、守備範囲の広い工程です。抗体医薬では、Protein Aキャプチャーとイオン交換に続く2段目・3段目のポリッシング捕捉工程の後、電荷や疎水性の違いを使って残った副産物を削り純度を上げる磨き上げ精製。として組み込まれることが多く、Q6Bが求める純度・不純物プロファイル製造プロセスに由来する類縁物質・分解物・プロセス関連不純物の種類と量を包括的に把握した品質情報の集合体。の作り込みを担います。

運転様式と温度──使いこなしの勘所

運転様式は二つあります。目的物を一度吸着させて溶出する バインドエリュート目的物を担体に結合させ、塩濃度やpHを変えて溶出させる運転様式。溶出の分画により凝集体などの不純物を分離・除去できる。⁠（分離能が高い）と、目的物を素通りさせて不純物・凝集体を吸着させる フロースルークロマトグラフィーで担体に結合せず素通りして流れ出る画分。不純物を通過させて除く場合などに利用する。⁠（処理量が大きくシンプル）です。凝集体の量や目標純度製品にどれだけ目的物質だけが含まれ、不純物や変性体が少ないかを示す指標です。抗体では単量体の割合やサイズの異なる成分の量などを見ます。詳しく →に応じて選び、凝集体が少なく高処理量を優先するならフロースルー、しっかり分けたいならバインドエリュートが基本の考え方になります。

見落とされがちなのが 温度 です。疎水性相互作用はエントロピー駆動のため、温度が上がると吸着が強まる方向に働きます。したがってラボと製造現場で室温が違えば溶出位置がずれることがあり、温度を管理条件に入れておくことが再現性の担保につながります。加えて、ロード量（担体カラムに充填する多孔質ビーズ。表面のリガンドと成分の相互作用差で目的物と不純物を分離する。あたりの負荷）や線速度も分離に影響するため、スケールアップでは滞留時間抗体が標的に結合し続ける時間。解離の遅さ（小さいkd）で長くなり、効き続けやすさに関わる。や負荷量を揃える設計が要になります。

塩の悩みどころと代替

設計上の悩みどころは塩です。高塩で吸着させるHICは大量の硫安を消費し、廃液・粘度液体の流れにくさを表す物理的性質で、タンパク質濃度の上昇に伴い非線形に増大する。・後工程の脱塩負荷につながります。ロード前に試料を高塩に調整する手間も生じます。そこで、塩をほとんど使わずに運転する「無塩（低塩）HIC」や、ミックスモードとの使い分けも検討されます。ミックスモードイオン交換基と疎水性基を同じリガンドに併せ持ち、複数の相互作用で分ける樹脂。は疎水性とイオン性を一つのリガンドに併せ持つため、塩を大量に使わずに直交原理（物差しの向き）の異なる手法を重ねて品質を評価する考え方。単一手法の死角を減らす。性を得られる場面があります。リガンドは疎水性の強さ（フェニル＜ブチル＜オクチル…）で選び、強すぎると溶出しにくく、弱すぎると分離できないため、対象分子に合わせて調整します。芳香族（フェニル）は疎水性に加えてπ相互作用も持つなど、リガンドごとの個性も選定材料になります。

工程での位置づけと条件出し

抗体プラットフォームでは、HICはProtein A捕捉とイオン交換に続く磨き上げ（ポリッシング）として組み込まれることが多く、電荷で削り切れなかった凝集体や疎水性の近いHCPを落とす役回りを担います。条件出しでは、まずリガンド（フェニル・ブチル等）と塩の種類を選び、次に「単量体と凝集体が分かれるロード塩濃度・溶出勾配」を探ります。担体への負荷量（ロード密度）を上げすぎると分離がぼやけるため、分離能と処理量のバランスも同時に詰めます。近年は、小型カラムや96ウェル形式のハイスループットスクリーニング化合物を一つずつウェルに分けて活性を測る従来型の大量探索法。混ぜて選ぶDELと対比される。で、塩・pH・勾配をDoE的に一気に振って最適点を絞り込むのが実務です。

なお、HICは分取（精製）だけでなく 分析 でも活躍します。代表がADC（抗体薬物複合体）の薬物抗体比抗体薬物複合体(ADC)で、抗体1分子に結合した薬物の平均数です。効果と安全性を左右するため測定する指標です。詳しく →（DAR）分析で、結合した薬物の数だけ疎水性が段階的に変わるため、HICでDAR分布DAR0/2/4/6/8などの構成比。平均が同じでも分布の形しだいで製品の性質が変わる。を分離・定量できます。「疎水性で分ける」という一つの原理が、凝集体除去からADC標的を選ぶ抗体に、細胞傷害性の薬物（ペイロード）をリンカーでつないだ分子。の品質評価まで幅広く効くわけです。

まとめ

HICは疎水性の違いで分ける、イオン交換に直交した精製モードです。高塩で吸着・低塩で溶出という独特の作法を持ち、凝集体が単量体より疎水的になる性質を使って、ポリッシングでの凝集体除去に力を発揮します。塩の選び方（Hofmeister系列）、温度、リガンドの設計、バインドエリュートとフロースルーの選択が要で、塩の負荷を減らす無塩HICやミックスモードとの併用も現実的な選択肢です。

参考文献

• Chen, J. et al., Purification of monoclonal antibodies by hydrophobic interaction chromatography under no-salt conditions（mAbs／PMC, 2013）
• Gagnon, P., Recent advances in application of hydrophobic interaction chromatography for aggregate removal in industrial purification process（J Chromatogr A, 2009）
• Cytiva, Hydrophobic interaction and reversed phase chromatography — Principles and methods（handbook）
• ICH医薬品規制の国際調和を目的として、日米欧の規制当局と製薬業界が参加する国際的なガイドライン策定機関。, Q6B Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products