ADCのDARとは？薬物を多く載せても効き目が上がらないのはなぜか

「抗体に載せる薬物の数を増やせば、1回の送達ゲノム編集ツールや核酸医薬などを標的細胞・組織まで安全かつ効率よく運ぶための技術・方法論の総称。詳しく →でより多くの細胞を殺せるのではないか？」

直感的には、抗体1分子あたりの薬物結合数（DAR抗体薬物複合体(ADC)で、抗体1分子に結合した薬物の平均数です。効果と安全性を左右するため測定する指標です。詳しく →：Drug-to-Antibody Ratio）を高くするほど、ADC標的を選ぶ抗体に、細胞傷害性の薬物（ペイロード）をリンカーでつないだ分子。詳しく →の細胞傷害活性は高まるように思えます。

ところが、ADCの開発では以前から、DARを高めるとかえって生体内での薬効が頭打ちになり、血中クリアランスが速くなることが知られていました。

一方で、現在臨床で広く使われている次世代ADC（エンハーツやトロデルビなど）は、DAR 7〜8という高い搭載量で承認を取得しています。

なぜ過去の開発では高DAR化がうまくいかず、現在のADCでは成立しているのでしょうか。

本記事では、Hamblettらの古典的な実験が示した高DARの問題点、高DAR化を支える技術的要因、結合手法によるDAR分布DAR0/2/4/6/8などの構成比。平均が同じでも分布の形しだいで製品の性質が変わる。詳しく →の違い、そして製造現場で管理すべき副生成物（断片化主鎖が切れて分子が分かれる劣化。低分子量体（LMW）として現れ、酸性側などで進みやすい。詳しく →と凝集体）のモニタリング手法を解説します。

混合物の平均値：ADCのDARは「単一の数値」なのか？

DAR（Drug-to-Antibody Ratio）とは、製造したADC全体で、抗体1分子あたりに結合している薬物分子の平均個数です。

低分子医薬品化学合成によって製造される比較的分子量の小さな有機化合物の医薬品で、バイオ医薬品と区別される。詳しく →なら、有効成分は単一の構造式で定義されます。ところが多くのADCでは、「DAR 4」はすべての抗体に薬物が4個ずつ結合している状態を意味しません。

1回の結合反応（コンジュゲーション）では、次のような分子が同時に生成します。

• 搭載数の不均一性⁠：薬物が0個の未結合抗体（DAR 0）から、2個、4個、6個、8個（場合によっては奇数個やそれ以上）が混在する。
• 位置の不均一性（位置異性体）：同じDAR 4であっても、Fab重鎖の一部と軽鎖がジスルフィドで連結した約50kDaの抗体フラグメント。2本鎖で折りたたみがやや複雑。詳しく →領域のシステインに結合しているか、ヒンジ領域に結合しているかで異なる分子となる（ADCの位置異性体）。

図をダウンロード（会員・無料）

同じ平均DAR「4.0」でも、DAR 4の単一ピークに近い狭い分布の製品と、DAR 0からDAR 8まで広く混在する製品とでは、生体内での薬物動態投与した薬が体内で吸収・分布・代謝・排泄されていく挙動。ADCではDARが大きく影響する。詳しく →や安全性プロファイルが大きく異なります。

重要：薬物を8個載せても、4個より効き目が上がらなかったのはなぜか？

試験管内（in vitro生きた動物の体外で、試験管やシャーレなどを用いて細胞・組織・分子レベルで行う実験を指す用語。詳しく →）で活性の強い分子が、生体内（in vivoin vivo（インビボ）とは、ラテン語で「生体内で」という意味で、生きた動物やヒトの体の中で調べたり作用させたりすることです。試験では、物質が吸収・代謝を受けた実際の状態での影響を見られます。詳しく →）でも有効性が高いとは限りません。

それを示したのが、Hamblettら（2004年）による抗CD30抗体-MMAE複合体の研究です。システイン結合抗体の鎖間ジスルフィドを部分還元して生じるチオール基に薬物を結合させる方式。偶数のDAR分布になりやすい。詳しく →法でDAR 2、DAR 4、DAR 8のADCを作り分け、比較しています。

• 培養がん細胞での細胞傷害活性（in vitro）：薬物の数にほぼ比例し、DAR 8 ＞ DAR 4 ＞ DAR 2 の順に強くなった。
• マウス腫瘍モデルでの抗腫瘍効果（in vivo）：同一抗体投与量において、DAR 8の抗腫瘍効果はDAR 4と同程度にとどまった。
• 血中動態（クリアランス）：DAR 8の分子は、DAR 4の約3倍、DAR 2の約5倍の速さで血中から消失した。
• 耐用量（安全性）：最大耐用量（MTD）は、DAR 4がDAR 8の2倍高かった。

図をダウンロード（会員・無料）

なぜDAR 8は、体内で期待どおりの効果を示さなかったのか。主な原因の一つは、MMAEの疎水性の高さです。

疎水性の薬物を抗体表面に多数配置すると、分子全体の疎水性が高まります。すると、肝臓の類洞壁細胞や細網内皮系（RES）に非特異的に捕捉されやすくなる。腫瘍組織へ移行する前に血中から速やかに消失し、薬物数を2倍にした利点が生体内で相殺されました（ADCの体内動態）。

設計の組み合わせで成り立つ：なぜ「現代の高DAR（DAR 7〜8）製品」は成立しているのか？

Hamblettらの実験は、高DARそのものが成り立たないことを示したものではありません。示したのは、疎水性の高い薬物を当時のリンカーADCで抗体とペイロードをつなぐ部分。両者の結合や体内での薬物放出の性質を左右する。詳しく →設計で高密度に結合させた場合の制約です。

現在、以下の製品は DAR 7〜8 という高い搭載量で承認を取得しています。とはいえ、2つの製品の設計の考え方は同じではありません。

• トラスツズマブ デルクステカン（エンハーツ）：平均DAR 約7.8 親水性を高めたテトラペプチド（GGFG）リンカーと、エキサテカン誘導体（DXd）を組み合わせ、高DARでも抗体本来の挙動に近い良好な物性と血中動態を維持。さらに放出されたDXdは細胞膜透過性化合物が細胞膜を透過する速さの指標。経口薬の吸収性の評価に使われる。詳しく →が高いため、強いバイスタンダー効果を示す。
• サシツズマブ ゴビテカン（トロデルビ）：平均DAR 約7.6 抗TROP-2抗体に、短いPEG化ポリエチレングリコールを結合させ見かけの分子サイズを大きくし、血中半減期を延ばす手法。リンカーを介してトポイソメラーゼI阻害薬SN-38を結合。pH感受性の炭酸エステル結合を含む切断型リンカーを採用し、高用量投与と腫瘍内外での効率的な薬物放出を狙った設計。

高DAR化は、単一の要素では成立しません。リンカーの親水性、血漿中安定性、ペイロード抗体薬物複合体(ADC)で抗体に結合させる強力な細胞毒(薬物)です。抗体によって標的の細胞まで運ばれ、そこで細胞を殺す作用を担います。詳しく →自体の物理化学的性質（疎水性や膜透過性）、結合様式、さらには製剤処方がそろって初めて成り立ちます。

図をダウンロード（会員・無料）

分布の形は結合手法で決まる：DAR分布は、どのケミストリーで制御するのか？

抗体のどのアミノ酸に結合させるかで、得られるDAR分布の形はほぼ決まります。

図をダウンロード（会員・無料）

リシン結合の不均一性

抗体表面に多数存在するリシンのアミノ基に対する、ランダム修飾です。平均DAR（例：3.5）は反応試薬のモル比で調整できます。ただし未結合抗体（DAR 0）から過剰修飾体までが幅広く混在し、位置異性体の組み合わせは膨大になります。

鎖間システイン結合（現行の主流）

IgG1抗体の重鎖・軽鎖間を繋ぐ4本の鎖間ジスルフィド結合システイン残基どうしが作るS-S結合。タンパク質の立体構造を留める橋になる。詳しく →を還元剤（TCEP等）で部分的に還元し、生じたチオール基システイン残基が持つ-SH基。ジスルフィド結合の還元で生じ、マレイミドなどと結合する反応点になる。詳しく →にマレイミドチオール基と選択的に結合する反応基。システイン結合型ADCで薬物リンカー側に用いられる。詳しく →型薬物リンカーを付加します。ジスルフィド結合が1本切れるごとに反応点が2個ずつ生じるため、通常は偶数種（DAR 0, 2, 4, 6, 8）が主に生成します（※不完全な反応等により微量の奇数種が生じる場合もあります）。

プロセス開発の要点：平均DARの裏で増える「断片」と「凝集体」

還元剤の添加量や反応時間を調節すれば、目標とする平均DAR（例：4.0）に数値を合わせること自体は難しくありません。

実務で最も注意したいのは、その逆の場面です。平均DARは目標に合っているのに、分子の物理的完全性（構造が保たれていること）が損なわれている。

① 鎖間ジスルフィド切断に伴う「断片化（Fragmentation）」

鎖間システイン結合では、構造維持に寄与していた共有結合をあえて切断します。還元条件が過剰になると、非共有結合性の相互作用だけで繋がった不安定な分子が増えます。非還元CE-SDSSDSで処理したタンパク質をキャピラリー電気泳動で分離し、抗体などの純度や分子サイズ分布（断片・凝集）を評価する手法です。詳しく →や変性SEC分子を天然に近い条件でサイズにより分ける液体クロマトグラフィー。凝集体の主要な定量法。詳しく →分析で、軽鎖単体（L）や重鎖抗体を構成する2種類のポリペプチド鎖のうち分子量が大きい方で、抗体の基本骨格と主要な機能領域を担う。詳しく →2量体（H2）といった断片のピークが増えるのはこのためです。

② 有機溶媒と疎水性相互作用による「凝集（Aggregation）」

多くのペイロードは難水溶性です。そのため結合反応時には、DMA（ジメチルアセトアミド）やDMSO水に溶けにくい薬物やリンカーを溶かし込み、抗体との結合反応を進めるために少量加える有機溶媒です。詳しく →などの水溶性有機溶媒を一定比率で共存させます。有機溶媒の濃度が高すぎたり、添加時に局所的に高くなったりすると、抗体タンパク質がアンフォールディングし、不可逆的な凝集体タンパク質分子どうしが結合してできた高分子量の集合体です。有効性や免疫原性に影響するため、その含量を測ります。詳しく →（HMW）の増加につながります（凝集体の分析法）。

まとめ：DAR決定に向けた実務チェックフロー

• ペイロードの物性スクリーニング⁠：疎水性（LogD）や膜透過性を評価する。高疎水性かつ強力な薬物であれば低DAR（2〜4）を、親水性リンカーと組み合わせた中力価薬物であれば高DAR（6〜8）を出発点として検討する。
• 結合ケミストリーの選定⁠：抗体遺伝子の改変を行わずに進めるならシステイン還元法、分子均一性を最優先するなら部位特異的変異導入法を検討する。
• 直交性の高い分析系の確立⁠：DAR分布を分離・定量するための疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）高塩条件で疎水性の違いを利用して結合・分離する方式。凝集体や疎水性の高い変性体を分ける。詳しく →、分子量を直接決定するネイティブLC-MS液体クロマトグラフで成分を分離したうえで質量分析計にかけ、分子量を測って物質の同定や定量を行う手法です。詳しく →、凝集を監視するSECの3系統を整備する（DARと遊離薬物の分析）。
• 小スケールでの反応最適化（DoEパラメータを変えたときCQAがどう応答するかを効率よく調べる実験計画法。詳しく →）：還元剤当量、薬物リンカー当量、有機溶媒比率、反応温度をパラメータとして振り、平均DAR、DAR分布、HMW率、遊離薬物残存率のトレードオフ曲線を引く。

平均DARの設計と製造管理が固まったあと、分子の不均一性をさらに減らすための技術が、次の記事で解説する部位特異的コンジュゲーション抗体などの決まった位置にだけ薬物や標識を結合させる手法です。結合数や位置がそろい、品質の均一な製品を作りやすくなります。詳しく →です。

参考文献

• Hamblett KJ, et al. Effects of Drug Loading on the Antitumor Activity of a Monoclonal Antibody Drug Conjugate. Clin Cancer Res. 2004;10(20):7063-7070.
• Conilh L, et al. Payload diversification: a key step in the development of antibody-drug conjugates. J Hematol Oncol. 2023;16(1):3.
• ICH Q6B生物薬品の規格・試験方法の設定の考え方を示すICHガイドライン。力価などの規格を扱う。詳しく →: Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products.
• FDA Guidance for Industry: Clinical Pharmacology Considerations for Antibody-Drug Conjugates (2024).