ミックスモード（マルチモーダル）クロマトグラフィーとは？

二つの相互作用を一つのリガンドで

ミックスモードイオン交換基と疎水性基を同じリガンドに併せ持ち、複数の相互作用で分ける樹脂。のリガンドは、たとえば荷電した基と疎水的な基を一体に持ちます。タンパク質はこの両方と同時にやり取りするため、「電荷は似ているが疎水性が違う」「疎水性は同じだが電荷が違う」といった、単一モードでは見分けにくい差も分離に使えます。イオン交換とHIC分子表面の疎水性の違いを利用して分けるクロマト担体で、高い塩濃度で吸着させ塩を下げて溶出させます。抗体の凝集体除去などに使われます。詳しく →を別々に二段流すのではなく、その直交性塩基と酸のように外れる条件が異なる保護基を組み合わせ、互いに干渉させない設計。を一つの担体カラムに充填する多孔質ビーズ。表面のリガンドと成分の相互作用差で目的物と不純物を分離する。で実現する、というイメージです。

代表的な担体には、陽イオン交換負に帯電した担体に正電荷のタンパク質を静電的に吸着させて分離する手法。抗体のポリッシングに広く使う。に疎水性を組み合わせたもの（弱陽イオン交換＋疎水基）や、陰イオン交換正に帯電した担体に負電荷の物質を吸着させて分離する手法。フロースルーでDNAやウイルスを除くのに使う。に疎水性を組み合わせたものがあり、市販の実績あるレジンクロマトグラフィーで目的物や不純物を結合させる粒子状の充填材。精製モードごとに使い分ける。としてレジン選定の選択肢に定着しています。リガンドによっては、静電・疎水に加えて水素結合やπ相互作用も寄与し、分離の自由度をさらに広げます。

単一モードにない振る舞い

ミックスモードの魅力は、単純なイオン交換や疎水性クロマトにはない挙動にあります。

一つは 塩耐性のキャプチャー精製の最初に、目的の抗体を担体にまとめて捕まえ一気に純度を上げる工程。Protein Aが代表。 です。通常の陽イオン交換は塩が高いと吸着できませんが、疎水性の寄与が加わることで、比較的高い電気伝導度溶液のイオン濃度を反映する指標。フロースルーでは負荷液の伝導度を下げる脱塩が必要になることがある。でも目的物を捕まえられます。これにより、前工程の高塩溶液を希釈せずにロードできる場面が生まれ、脱塩や希釈のステップを省いて工程を簡素化できます。Protein Aキャプチャーを持たない非抗体タンパク質で、初期捕捉の選択肢として使われることもあります。

もう一つが 分離能 です。凝集体は単量体と電荷が近くても疎水性が異なることが多く、ミックスモードなら電荷と疎水性の両面から差をつけて分けられます。このためポリッシング捕捉工程の後、電荷や疎水性の違いを使って残った副産物を削り純度を上げる磨き上げ精製。段で、HCPや凝集体タンパク質分子どうしが結合してできた高分子量の集合体です。有効性や免疫原性に影響するため、その含量を測ります。詳しく →、漏出リガンド、残存DNA製造に使った宿主細胞に由来するDNAの不純物です。安全性の観点から、精製後にどれだけ残っているかを測る試験です。詳しく →をまとめて落とすポリッシング工程として使われます。

バインドエリュートとフロースルー

運転様式は二つに大別されます。目的物を吸着させてから溶出する バインドエリュート目的物を担体に結合させ、塩濃度やpHを変えて溶出させる運転様式。溶出の分画により凝集体などの不純物を分離・除去できる。 は分離能が高く、塩耐性キャプチャーや高分離のポリッシングに向きます。一方、目的物を素通りさせて不純物だけを吸着させる フロースルークロマトグラフィーで担体に結合せず素通りして流れ出る画分。不純物を通過させて除く場合などに利用する。 は、処理量を稼ぎながら磨き上げられるのが強みです。抗体のポリッシングでは、陰イオン交換系のミックスモードをフロースルーで使い、凝集体・HCP医薬品を作る宿主細胞に由来するタンパク質の不純物です。安全性に関わるため、精製後の残存量を測ります。詳しく →・DNA・ウイルスをまとめて削ぐ設計がよく採られます。目的物が素通りするため大量処理に向き、ロード量を上げても純度製品にどれだけ目的物質だけが含まれ、不純物や変性体が少ないかを示す指標です。抗体では単量体の割合やサイズの異なる成分の量などを見ます。詳しく →を保ちやすいのが利点です。

使いこなしの勘所──pHと電気伝導度

ミックスモードは自由度が高い分、条件出しが要になります。挙動を決める主なつまみは pH と 電気伝導度溶液の電気の通しやすさで塩濃度の目安になる指標。クロマトの溶出やプール判定の管理に使う。 の二つです。pHはタンパク質とリガンドの荷電状態を変え、電気伝導度（塩濃度）はイオン性の寄与を弱めて相対的に疎水性の寄与を強めます。二つを動かすと吸着・溶出の窓が二次元的に変わるため、バインドエリュートとフロースルーのどちらで使うかも含め、DoE（実験計画法）複数の因子を効率よく振り、少ない試験数で傾向をつかむための実験の計画手法。的に最適点を探すのが実務です。

裏を返せば、条件が最適点から外れると挙動が急に変わりやすく、頑健な運転域（デザインスペース品質が保証されると実証された、工程パラメータや原材料特性の多次元的な組み合わせの領域。）を見極める手間がかかります。溶出やCIPタンクや配管を分解せず設置したまま洗浄(CIP)し、蒸気などで滅菌(SIP)する仕組みです。詳しく →（定置洗浄）でリガンドから完全に脱着させにくい場合もあり、再生条件の作り込みも設計の一部です。自由度の高さは強みであると同時に、設計に手間がかかる裏返しでもあります。

運転の実際──溶出と再生

具体的な使われ方を二つ挙げます。一つは、陰イオン交換系のミックスモードを フロースルー で使う抗体ポリッシングです。中程度の電気伝導度でロードすると、目的の抗体は素通りし、凝集体・HCP・DNAが担体に捕まります。もう一つは、陽イオン交換系のミックスモードを バインドエリュート で使う塩耐性キャプチャーで、前工程の高塩溶液をそのままロードし、pHを上げるか塩を加えて溶出します。

運転設計で見落とせないのが 溶出と再生 です。ミックスモードは複数の相互作用で保持するぶん、単一モードより脱着に手間がかかることがあり、溶出はpH変化・塩・またはその組み合わせで設計します。使用後のCIP（定置洗浄）では、疎水的な相互作用で残った成分を落とし切るために水酸化ナトリウムに添加剤を組み合わせるなど、再生条件も作り込みます。ここを詰めておかないと、担体の寿命（繰り返し使用での性能維持）に響きます。

HICとの使い分け

同じ疎水性を使うHICとの違いは、ミックスモードが疎水性に加えてイオン性を併せ持つ点にあります。HICは高塩ロードが前提で硫安などを大量に使いますが、ミックスモードは塩をあまり使わずに直交原理（物差しの向き）の異なる手法を重ねて品質を評価する考え方。単一手法の死角を減らす。性を得られる場面があり、廃液や脱塩負荷を減らせることがあります。一方、条件出しの難しさや溶出設計の複雑さはミックスモードの方が大きくなりがちです。凝集体除去という目的が同じでも、塩負荷・処理量・分離能のどれを優先するかで、両者を使い分けます。

まとめ

ミックスモードは、イオン性と疎水性などを一つのリガンドに併せ持ち、直交性を単独で実現するクロマトです。塩耐性キャプチャーや、電荷の近い凝集体の分離といった、単一モードにない振る舞いを示し、ポリッシングでの凝集体・HCP除去に力を発揮します。pHと電気伝導度という二つのつまみを使いこなし、頑健な運転域を見極めることが、その自由度を活かす鍵になります。

参考文献

• Zhao, Y. et al., Antibody Aggregate Removal by Multimodal Chromatography（PMC, 2025）
• Gagnon, P., Recent advances in application of hydrophobic interaction chromatography for aggregate removal in industrial purification process（J Chromatogr A, 2009）
• ICH医薬品規制の国際調和を目的として、日米欧の規制当局と製薬業界が参加する国際的なガイドライン策定機関。, Q6B Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products