封入体の可溶化
破砕・洗浄した封入体を高濃度の尿素・グアニジンと還元剤で完全に変性・解離し、後段で扱える可溶化液にする。
- 尿素6〜8M/グアニジン4〜6M
- 還元剤で-S-S-を切断
- 凝集体を単量体へ解離
封入体可溶化・リフォールディング試薬は、大腸菌などで不溶性凝集体(封入体)として発現した組換えタンパク質を、高濃度変性剤(尿素・グアニジン)と還元剤で可溶化し、変性剤を除きながら酸化還元対やアルギニン等の添加剤で活性体へ巻き戻すための試薬・バッファ群。微生物発酵のダウンストリーム初段、精製クロマトの前段で用いる。
大腸菌などの微生物で組換えタンパク質を高発現させると、目的タンパク質が不溶性の凝集体(封入体)として蓄積することが多い。本製品群は、菌体破砕で回収した封入体を高濃度の変性剤(尿素6〜8M、塩酸グアニジン4〜6M)で可溶化(変性・解離)し、続いて変性剤を段階的に除いて天然の立体構造へ巻き戻す(リフォールディング)ための試薬・バッファ・添加剤をまとめたものである。可溶化時は還元剤(DTT・β-メルカプトエタノール・TCEP)でジスルフィド結合を切り、システインを還元状態に保つ。
リフォールディングの成否は、目的タンパク質の凝集を抑えつつ正しいジスルフィド架橋を形成させる条件設計にかかる。変性剤を希釈または透析・ダイアフィルトレーションで除く過程で、酸化還元対(還元型/酸化型グルタチオン GSH/GSSG、シスタミン/システイン等)を加えてジスルフィドのシャッフルを促し、アルギニン(0.4〜1M程度)や非変性濃度の尿素、糖・ポリオール、界面活性剤などの凝集抑制剤(aggregation suppressor)で会合を抑える。pH・温度・タンパク質濃度・希釈速度も重要な変数になる。
選定軸は、変性剤の種類とグレード(不純物・吸光・エンドトキシン)、還元剤の選択(におい・酸化安定性・金属感受性)、酸化還元対と添加剤の最適化幅、そしてスケールでの除去方式(希釈リフォールディング/パルス希釈/on-columnリフォールディング/透析・TFF)である。条件は分子ごとに経験的に決まるため、添加剤マトリクスを振るスクリーニングと、活性・単量体率での評価を前提に設計する。
菌体破砕で回収・洗浄した封入体を可溶化し、変性剤を除きながら活性体へ巻き戻す。条件は希釈・透析・on-columnなど除去方式に合わせて設計する。
微生物(主に大腸菌)系の組換えタンパク質製造で、封入体の可溶化から活性体回収までの初期ダウンストリームに用いる。
破砕・洗浄した封入体を高濃度の尿素・グアニジンと還元剤で完全に変性・解離し、後段で扱える可溶化液にする。
変性剤を希釈・透析・TFFで段階除去し、酸化還元対と凝集抑制剤の存在下で天然構造とジスルフィド架橋を再形成する。
pH・温度・タンパク質濃度・酸化還元比・添加剤を振る小スケール検討で、活性回収率を最大化する設計空間を固める。
巻き戻し後の液を、後段のクロマト(IEX・HIC・SEC等)に適合する塩濃度・pH・伝導度へ整える前処理に使う。
大腸菌など微生物で発現させ封入体化しやすいタンパク質で関連度が高く、細胞・遺伝子治療では限定的。